经典案例 | 龙葵基因组辅助发现马铃薯晚疫病效应子受体并揭示其抗病基因功能
今年8月，岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心、韩国浦项科技大学和英国东英吉利大学塞恩斯伯里实验室联合通讯，在Nature Genetics上发表了研究成果，生成了四个茄属植物龙葵的高质量参考基因组，重新测序了52个品种，并克隆了3个新的免疫受体Rpi-amr4、R02860和R04373。
文章题目
Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors
第一作者：Xiao Lin, Yuxin Ji
通讯作者：Xiao Lin, Sanwen Huang, Kee Hoon Sohn, Jonathan D. G. Jones
通讯单位：岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心、韩国浦项科技大学和英国东英吉利大学塞恩斯伯里实验室联合通讯
杂志：Nature Genetics
影响因子：30.8/Q1
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41588-023-01486-9
研究背景
马铃薯是世界上消费量最大的非谷物作物之一，而病虫害使得全球产量减少了约17%，马铃薯晚疫病至今仍是全球马铃薯生产中最具破坏性的疾病。植物的免疫依赖于细胞表面模式识别受体(PRRs)和细胞内免疫受体对病原体的识别。目前从马铃薯野生近缘种中克隆出了许多抗大肠杆菌的R基因(Rpi基因)，然而，大多数克隆的Rpi基因都被快速进化的病原体所攻克。
晚疫病菌效应子携带信号肽和RXLR-EER基序(其中X代表任意氨基酸)，在晚疫病菌参考基因组(菌株T30-4)中预测出了563个RXLR效应子，实现了在各种植物中识别这些效应子的筛选(“效应组学”)。目前的研究中，马铃薯、番茄、茄子和辣椒的参考基因组序列已经确定，异源二倍体和四倍体马铃薯的染色体水平的分阶段基因组组装也已经完成，对包括马铃薯在内的农作物进行的泛基因组研究也揭示了这些物种中的广泛遗传变异。序列捕获方法已经发展到对植物NLR(RenSeq)和PRR(RLP/KSeq)基因库进行测序，从而降低了基因组的复杂性和测序成本。
技术方案
基因组测序
表型鉴定结合比较基因组学分析
抗病基因克隆
研究意义
研究揭示了龙葵和晚疫病菌之间的效应子触发免疫(ETI)互作，表明龙葵是研究植物-微生物分子相互作用和植物免疫的优秀模式植物，有助于从野生茄属物种基因库中克隆更多Rpi基因，加深对马铃薯野生近缘种抗晚疫病的认识，有助于培育出具有持久抗晚疫病能力的马铃薯品种的同时也能够助力其他作物的病虫害防治。
▲龙葵基因组进化
二倍体龙葵(Solanum americanum)对晚疫病具有很强的抗性，之前的研究从几种抗性龙葵中克隆了Rpi-amr1和Rpi-amr3，以及它们的同源效应物AVRamr1和AVRamr3。研究人员通过PacBio、ONT、Illumina和Hi-C技术对龙葵的4个品种(SP1102、SP2271、SP2273和SP2275)进行测序，平均预测了34193个基因模型，每个龙葵基因组的平均BUSCO评估率为98.1%(单拷贝和重复)。
为了研究龙葵基因组的进化，研究人员将15个基因组的代表性蛋白序列(4个龙葵基因组、4个马铃薯基因组、3个番茄基因组、4个其他茄科物种和1个拟南芥外群物种)聚类为33115个正交群，并从中进一步鉴定出了1,363个单拷贝正交群。物种树拓扑结构表明，龙葵是马铃薯和番茄共同祖先的姐妹种，并在约14.1Mya前分化。
染色体重排是一个重要的进化过程，研究人员在龙葵和马铃薯基因组中观察到45个大型CRs(26个反转和19个染色体间易位事件)；龙葵和茄子之间发现了67个较大的CRs(30个倒位和37个染色体间易位)。CR在整个基因组中并非均匀分布，龙葵与马铃薯之间的2号染色体上没有发现CR，而在11号染色体上则发现了11个CRs。
▲龙葵泛NLRome
为了了解NLR基因的多样性，研究人员利用SP1102 NLR蛋白的NB-ARC结构域构建了系统发育树，并在物理图谱中可视化了这些NLR基因在SP1102基因组中的位置。结果表明，71%的SP1102 NLR基因呈簇，其余为单体。由于NLR基因簇的复杂性，大多数自动注释会产生错误基因模型。为了生成更高质量的NLR基因模型，研究者们结合NLR-annotator结果和cDNA序列数据，对SP1102、SP2271和SP2273基因组中的528、579和524个NLR基因进行了人工注释，并比较了龙葵NLR基因的P/A多态性，此外还建立了一个泛NLRome。
通过重新分析RenSeq cDNA数据来检测SP1102 NLR基因的表达水平，发现许多已知的NLR基因相对高表达。研究人眼构建了NRC基因的系统发育树，在龙葵基因组中发现了NRC1、NRC2、NRC3、NRC4a和NRC6同源基因，以及2个NRC5a同源基因。与烟草(2个同源基因)相比，龙葵基因组中的NRC4b基因(7个同源基因)有所增加。此前曾报道，烟草中的Rpi-amr3和Rpi-amr1分别需要NbNRC2/NbNRC3/NbNRC4NbNRC2/NbNRC3，而在烟草中缺少NRC1。为了验证龙葵的NRC1是否支持Rpi-amr1/Rpi-amr3功能，研究人员克隆了来自SP1102的SaNRC1，结果表明在烟草nrc2/mc3/mc4基因敲除植株中，SaNRC1能使Rpi-amr3触发功能，而非Rpi-amr1。这一结果表明，不同物种的不同成员可能会触发NRC功能。
▲龙葵和晚疫病菌的ETI互作
研究发现在大肠杆菌T30-4参考基因组中有563个预测的RXLR效应子，龙葵参考基因组中约有550个NLR基因。为了揭示效应子受体之间的一对一相互作用并克隆更多的免疫受体，研究人员在52个龙葵品种中筛选了315个晚疫病菌RXLR效应子。结果发现，5种效应子在大多数龙葵种质中引发了超敏反应(HR)，其中包括AVRblb2家族的效应子；而有185种效应子在所有龙葵中都没有触发HR，71 种效应子被少于5个龙葵种质接种识别，54种效应子在不同龙葵接种上表现出差异识别；AVRamr1(36/52)和AVRamr3(43/52)也被不同龙葵品种广泛识别， 4个龙葵参考种质分别能识别25个、18个、30个和30个RXLR效应子。在DLA实验中，SP2271对晚疫病菌易感，但易感程度与年龄有关，而该品种在田间对晚疫病表现出抗性；正如预期的那样，SP2271不能识别AVRamr1和AVRamr3，而这一种质中有25个RXLR效应子触发了HR，这些 RXLR效应子识别可能是SP2271对晚疫病具有年龄依赖性抗性和田间抗性的原因。综上，这些结果揭示了龙葵基因组与晚疫病菌之间的效应子触发免疫(ETI)相互作用。
▲Rpi-amr4及其效应子PITG_22825的鉴定与表征
在效应子组学筛选过程中，研究人员发现了一种效应子PITG_22825，它能在52份龙葵材料的28个中触发HR(包括SP1102和SP2271，但不包括 SP2298)。P作为一种RXLR效应子，其信号肽RQLR和EER基序位于效应子结构域之后。为了确定其识别基因进行了GWAS分析，并在SP1102的01号染色体上的NLR单体中发现了一个强信号，该基因编码的CNL属于CNL-13 Rpi-amr3进化支，表明1号染色体上的候选基因可能是从11号染色体上的Rpi-amr3位点易位而来的，这可能是11号染色体Rpi-amr3基因簇中另一个较弱GWAS信号的原因。基于SP1102的cDNA RenSeq数据，与Rpi-amr3相比，相应的NLR基因多了一个外显子。为了验证这一GWAS信号，研究人员对SP2271xSP2298的F2群体进行了大量分离分析和抗性基因富集测序(BSA-RenSeq)，发现在SP2271和SP1102参考基因组中，来自SP2271的PITG_22825应答基因定位在1号染色体上的相同位置。
为检测基因功能，对SP2271和SP1102候选基因的ORFs进行PCR扩增，并将其克隆到含有35S启动子和Ocs终止子的过表达二元载体中，然后将构建的ORFs转化到农杆菌中。发现SP2271等位基因(以下简称Rpi-amr4-2271)在烟草中是自动激活的，但当它与PITG_22825共表达时，其HR发生速率更快、效应更强；相比之下SP1102等位基因并非如此，Rpi-amr4-1102与PITG_22825共表达时触发HR，而AVRamr3-GFP不触发。
为了验证Rpi-amr4的功能，利用CRISPR-Cas9构建了敲除Rpi-amr4的SP2271，发现野生型SP2271能识别PITG_22825，而Rpi-amr4敲除系不能识别。结合分析可得出结论，Rpi-amr4编码识别PITG_22825的免疫受体，而PITG_22825则为Avramr4。研究人员成功克隆了一个新的Rpi基因Rpi-amr4，并确定了其同源效应子基因Avramr4(PITG_22825)。
▲R02860和R04373的效应子识别
此外，研究人员还通过BSA-RenSeq、SMRT-RenSeq和基于图谱的克隆策略成功克隆了两个另外的免疫受体R02860和R04373，并定义了它们的识别RXLR效应子PITG_02860和PITG_04373。但相比Rpi-amr4，这些基因赋予的抗性较弱，无法在田间应用。许多效应子是宿主免疫的抑制因子，尤其是AVRcap1，它可以减弱辅助NLRs NRC2和NRC3的功能，这种衰减可能解释了为什么一些识别效应子的植物免疫受体却不能赋予很强的抗病能力。
