经典案例 | 茄科植物基因组揭示莨菪碱生物合成途径演化历史
近期，兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室在Nature Communications上发表了研究成果，对茄科植物中产生山莨菪碱和东莨菪碱(HS)的三个代表性物种和一个不产生HS的物种进行了基因组测序，揭示了HS生物合成途径的演化历史。
文章题目
Multiple independent losses of the biosynthetic pathway for two tropane alkaloids in the Solanaceae family
第一作者：Jiao Yang, Ying Wu, Pan Zhang, Jianxiang Ma, Ying Jun Yao
通讯作者：Jianquan Liu
通讯单位：兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室
杂志：Nature Communications
影响因子：16.6/Q1
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-44246-3#Sec10
研究背景
植物中存在的次生代谢物是强有力的进化选择的结果，在亲缘关系较远的品种中可以发现相同的植物次生代谢物，这表明自然选择曾多次发挥作用，通过生物和非生物压力产生了这些代谢物，包括抵御病原微生物和食草动物、与传粉昆虫的相互作用，以及抵御干旱、紫外线辐射和霜冻等。对此的另一种解释是，这些代谢途径可能起源于所有相关种系的最近共同祖先，这种特性在远缘种系中得以保留，但在一些近缘种系中可能由于逆向选择压力或多样化过程中的遗传漂变而丧失。
Tropane生物碱是多种吡咯类植物生物碱的成员，目前在茄科、旋花科等多个植物科中已发现300多种托品烷生物碱。据其生物合成和结构特征可分为几大类：如可卡因来源于古柯科，莨菪碱和东莨菪碱(HS)产自茄科。最近的研究表明，古柯科和茄科中存在的这些tropane生物碱是独立进化的，但通过酶表征可以看出其功能趋同。茄科植物中，有四个不同的系统发育和地理谱系生产HS。Datureae起源于南美洲，Mandragorinae和Hyoscyaminae(包括Atropa，之前被归为姐妹类群Lyciinae)发现于青藏高原及其邻近地区，Anthocercidae出现于澳大利亚。这些生物碱具有多种用途，经常用于神经毒剂中毒、帕金森病和神经肌肉疾病的治疗。然而，从相应植物中分离出的HS在全球供应量较低，因此，了解HS产生的遗传进化过程并找出负责该生成途径的特定基因和突变有助于生物合成工程，从而促进这两种具有生物活性和经济价值成分的产出。
但目前尚不清楚四个产生HS的谱系是否通过相同的生物合成基因来产生HS，遵循相同HS合成遗传途径，那么HS生物合成的独立起源很可能需要多个关键基因发挥趋同功能；或者，这些次生代谢物可能起源于一种祖先的途径，而这种途径在密切相关的种系中已经消失。
技术方案
PacBio HiFi➕ONT➕Hi-C测序
基因组比较分析
基因家族和系统发育分析
基因组突变和全基因组复制分析
微共线性分析
酶活性验证
研究意义
研究重点评估了远缘茄科谱系的HS生物合成演化历史， 相关基因的鉴定和关键突变对茄科作物HS合成途径的深入探索具有重要意义，有助于高效获取山莨菪碱和东莨菪碱这两种代谢物成分，为未来茄科作物中HS生物合成人工工程的潜在应用提供了宝贵参考价值。
▲4种茄科植物基因组特征综述
研究对三个产生HS的物种和一个不产生HS的物种进行了基因组测序，前者包括山莨菪(Anisodus tanguticus)、曼陀罗(Brugmansia arborea)和茄参(Mandragora caulescens)，分别来自茄科三个远亲谱系：Datureae, Hyoscyaminae和Mandragorinae；后者为枸杞(Lycium chinense)。最终得到的四个物种基因组大小分别为：山莨菪(1249 Mb, contig N50为23.80 Mb)，曼陀罗(1548 Mb，contig N50为7.70 Mb)，茄参(712 Mb，contig N50为25.26 Mb)以及枸杞(1538 Mb，contig N50为2.99 Mb)。
根据Hi-C数据，每个基因组中超过97.47%、97.42%、94.67%和98.57%的组装序列分别被锚定到24 个山莨菪染色体、13个曼陀罗染色体、24个茄参染色体和12个枸杞染色体中，四个组装的染色体水平基因组表现出高度一致性。BUSCO评估3个产生HS的物种完整性为98%，不产生HS的枸杞完整性为95%，表明四个基因组序列具有高度准确性、连续性和完整性。别预测出了四个基因组中的46,606个、54,946个、32,347个和 29,193个编码蛋白质的基因。与其他三个物种相比，曼陀罗基因组中预测重复元件的百分比大幅提高。转座元件(TEs)是被子植物基因组中最主要的重复序列形式，其在四个基因组中都是最丰富的重复亚型。
研究了茄科植物中三个在系统发育上不相关的产HS物种的多倍体化历史，对于每个基因组，在山莨菪中观察到一个大约0.5的小Ks峰，所有其他茄科物种都存在这一峰值，这与该家族共有的全基因组三倍化事件事件相符；还在山莨菪和曼陀罗中检测到了约0.15和0.20的大量Ks峰，表明存在可能具有谱系特异性的近期多倍化事件。为了阐明所有四个物种的多倍体化历史，研究人员利用葡萄和其他茄科植物进行了基因组比较评估，证实了山莨菪和曼陀罗与其他茄科物种一起经历了共同的祖先全基因组重复(WGT)事件，但也经历了各自特有的全基因组重复(WGD)事件。山莨菪和茄参的syntenydot图表明，每个物种中的每个片段都可以与另一个物种的两个最相关的synteny片段相鉴别，验证了这两个物种之间并不共享最近的WGD事件。
系统发育分析表明，P. axillaris经历了茄科植物中最早的分化，距今约27.33Mya；木本曼陀罗是茄科植物的姊妹群，两者与茄参、山莨菪和枸杞亲缘关系密切，包含一个从木本曼陀罗-茄科植物谱系中分化出来的支系，距今约21.17Mya。
▲两种HS合成基因的HS生物合成、表达谱和微共线性分析
鉴于山莨菪、曼陀罗和茄参都产生HS，它们可能有可能采用具有共同进化历史的保守途径来产生这些化合物。为了进一步评估这一点，研究人员进行了比较基因组分析，还将鉴定的基因与从三种产生HS的物种中分离出来的基因进行了比较。结果发现，这些基因在序列相似性和基因表达模式方面都有高度一致性，表明这些物种应该具有共同的HS生物合成途径。
为了更深入地了解这些基因在植物体内HS生物合成中的功能，研究人员从HS生物合成途径中选择了四个关键基因：TRI、LS、HDH和H6H，并利用为这种高山植物建立的VIGS技术进行验证。实验结果表明，抑制TRI、LS和H6H基因的表达预计会导致相应产物的减少，包括托品碱、山莨菪碱和东莨菪碱。因此得出结论，鉴定的候选基因是产生HS的物种生物合成HS所必需的。检测了每个产生HS的物种中可能包含这12种酶的基因簇，发现只有CYP82M3和TRI在山莨菪和曼陀罗中聚集在一起，其余基因在不同的基因组位点上相互隔离。进一步检测了已鉴定基因在三种产生HS的物种(叶、根、次生根和茎)的不同组织中的表达水平，发现所有候选基因都在三种物种的根和叶中表达，这些基因的表达在山莨菪的次生根中特别高，这也是能够从这些根中分离出高浓度HS的原因。
在缺乏特定性状的近缘物种中，与该性状关键基因相对应同源区块的保留可以证明祖先遗传途径的缺失。研究人员在12个HS合成基因中发现了11个高度保守的片段，除HDH外，这11个基因中有10个在茄科至少一个非产HS物种中具有同源基因和同源的完整或不完整基因。分析发现TRI基因树与茄科物种树的排列相似，表明TRI的进化史与茄科的种之间存在一定的关系。研究无法直接识别出三种产HS物种以及非HS产生物种之间的同源区块，但通过全基因组基因家族分析，候选的同源基因在这些物种中得到了验证，表明基因易位和同源基因侵蚀在谱系多样化过程中的潜力。与HS合成基因相对应的高度保守的synsynblock及其系统发育关系表明，HS合成途径很可能出现在所有茄科植物的共同祖先中。
▲LS和CYP80F1基因的微共线性分析
与其他HS合成基因相比，研究人员发现三个下游HS特异性基因LS、CYP80F1和HDH表现出不完整的基因结构，类似于非HS产生物种中的假基因。虽然无法在茄科非产生HS的物种中鉴定出HDH残基，但在旋花科物种中确认了其synsynblock和完整的基因结构，属于同一种茄属植物，具有密切的关系，表明HDH基因的祖先起源早于两个科之间的分化。非产HS物种中这些基因没有完整的基因结构可能与假基因化有关，假基因化导致了外显子的丢失；或者，这些基因可能存在于未采样的非HS产生物种中，随着高质量基因组的普及，将来可能会对这些基因进行研究。
这些结果突显了三种远缘产HS物种中HS合成基因的显著共线性，以及这些基因在非产HS物种和近缘家族中的部分或完全保留。此外，三个产HS物种每个基因座上的同源基因被确定为旁系，而非单系，这在趋同进化的情况下是可以预见的。因此，在非HS产生物种的共线区域中，下游HS合成基因的假基因化和丢失致了HS生物合成的大量缺失，而这些缺失是在最近的共同起源之后发生的。
▲茄科HS相关基因的系统发育模式
TRI基因是产生托品碱的必要基因，而托品碱是HS合成途径中的关键中间代谢物。以TRI为代表基因，研究人员打算研究这样一个假设：HS合成基因可能从其祖先起源开始就在非产HS物种中经历了功能减弱或缺失。研究人员分别对来自非HS产生马铃薯和HS产生曼陀罗的StTRI和BaTRI进行了功能增益和功能缺失突变实验。结果表明，在远缘产HS物种中，关键的TRI基因保持了其祖先的活性功能；与此相反，非HS生产物种虽然拥有整个TRI基因(如马铃薯)，但其功能却有所减弱甚至完全丧失，这可能是由于进化松弛所致。
▲对产生HS和不产生HS物种中的TRIs、TRI 突变体和LSs的酶活性进行了表征
在非产HS物种中，关键下游HS合成基因的功能丧失可能是通过与功能终止、基因假基因化和基因缺失有关的保守进化过程发生的，而这些基因在HS产生物种中保留了其祖先的功能。然而，研究人员观察到特定的非HS产生物种在HS合成途径下游仍有共线基因，即PPAR、CYP80F1、HDH和H6H。因此，研究这些来自非HS产生物种的基因是否保留酶功能是值得的。
为了研究PPAR的酶促功能，研究人员通过体外酶促实验对曼陀罗等三种植物进行验证。结果表明，HS合成途径可能出现在所有茄科谱系的共同祖先中，而这些基因在一些非HS产生物种中的丢失或假基因化导致HS在茄科中的分布有限。
▲PPAR、CYP80F1、HDH和H6H的酶活性表征
