经典案例 | 基因组、转录组和代谢组联合分析揭示蔷薇属植物空心泡花青素生物合成的基因组进化和分子机制
近期，贵州凯里学院大健康学院在Horticulture Research上发表了研究成果，通过基因组、转录组和代谢组联合分析，阐明了空心泡的进化动态历史以及花青素生物合成的分子基础。
文章题目
Chromosome-scale genome, together with transcriptome and metabolome, provided insights into the evolution and anthocyanin biosynthesis of Rubus rosaefolius Sm. (Rosaceae)
第一作者：Yunsheng Wang, Jiyuan Guan
通讯作者：Yunsheng Wang, Qunying Zhang
通讯单位：贵州凯里学院大健康学院
杂志：Horticulture Research
影响因子：8.7/Q1
文章链接：
https://doi.org/10.1093/hr/uhae064
研究背景
悬钩子属(蔷薇科)有12个亚属，700余个物种，分布在除南极洲以外的世界各地，东亚或北美西部可能是其起源中心，中国西南部可能是其多样性中心。蔷薇属植物的组织，尤其是成熟浆果，通常含有促进健康的丰富化合物(如花青素、酚酸和类黄酮)和营养物质(如纤维素、维生素E和天然色素)。近20年来，一些品种已被驯化和栽培，其种植面积和产量迅速增加。虽然大部分莓果具有很高商业价值，但却没有得到充分利用，目前对其研究主要集中在植物化学、药理学和基因组学方面，有关蔷薇物种基因组进化和重要生物特性的分子基础信息仅限于少数几个成员。
空心泡(Rubus rosaefolius)生长于东亚、东南亚、南亚、大洋洲、非洲和马达加斯加等地区，属于覆盆子的一种，其枝条、叶和根长期以来一直被用于止咳、祛风、止血、湿和清热等功效。成熟的空心泡果实含有丰富的生物活性成分，如花青素、酚类、三萜和甾醇，故具有多种药理作用，包括抗氧化、镇痛、抗菌、防腐、抗增殖、抗癌、利尿和减轻高血压等。因此，空心泡具有很大的驯化和栽培潜力。
技术方案
基因组➕转录组➕代谢组联合分析
研究意义
研究多维角度探讨了蔷薇科植物花青素生物合成和调控的遗传基础和分子机制，有助于描述蔷薇科果实中花青素合成和调控的特征，并为利用基因组编辑技术等生物技术手段对蔷薇科物种进行有针对性的驯化、繁殖和改良奠定基础。
▲空心泡染色体基因组特征
利用和Hi-C综合技术对空心泡进行测序，最终获得的基因组大小为219.02 Mb，占估计基因组大小的99.33%，包含138个contigs，N50为16.13 Mb，锚定在7条假染色体上。CEG和BUSCO评估组装完整性分别为99.56%和98.51%。
▲空心泡和其他9种植物的系统发育树及基因家族扩张与收缩统计
为了阐明空心泡红基因组的进化动态，研究人员对包括其在内的10个物种基因集数据进行了综合分析和比较，共有242,905个基因被聚类为38,785个正交群，这些基因编码的蛋白质含有100个以上的氨基酸。其中，有702个基因被归属于159个科，被鉴定为玫瑰镰刀菌空心泡的特异性基因。这些基因主要富集在“氨基酸生物合成”、“其他类型的o-聚糖生物合成”、“硫代葡萄糖苷生物合成”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成”等代谢途径中。
利用901个单拷贝基因家族构建的系统发育树表明，蔷薇科出现于白垩纪，覆盆子出现于古近纪，而空心泡与掌叶覆盆子在17.28~36.44Mya前从最近的共同祖先分化而来，随后空心泡的211个基因家族和36个基因家族分别得到扩张和收缩，扩张家族的基因主要富集于“DNA聚合酶”、“光合作用”、“昼夜节律”和“半乳糖代谢”等代谢途径。在用于构建系统发育树的901个单拷贝基因中，156个(17.31%)经历了正选择，富集于“卟啉和叶绿素”、“氨基酸生物合成”和“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成”等代谢途径。
▲空心泡及其近缘系基因组共线性分析
可以根据基因组的共线性模式推测物种间染色体变异动态，研究人员在空心泡和掌叶覆盆子的1号染色体一端及其他6条染色体上发现了完整且平行的同源物，但在1号染色体的另一端缺失了大的同源区块。这些发现表明，空心泡和掌叶覆盆子之间的染色体没有发生大的变异，但在二者中的某一基因组组装或注释可能出现了错误。
而后发现，空心泡和黑树莓之间所有染色体的共线性几乎没有改变，这表明上述1号染色体组装或注释中的错误很可能未发生在空心泡上。如果忽略染色体组型中的支架组装方向所造成的干扰，则发现1、2、3、5 和7号染色体几乎是完全平行的，4号染色体可能发生了较大的倒位，6号染色体可能发生了三个或更少的倒位。
对于空心泡和林地草莓，1、2、3、4和 6号染色体表现出完整的平行共线性，但5号和7号染色体的一端发生了大反转事件，5号染色体的反转事件发生在同一端，而7号染色体的反转事件发生在另一端。与 空心泡和掌叶覆盆子、黑树莓和香莓的基因组相比，香莓和空心泡的基因组，特别是桃和空心泡的基因组之间共线性较低。这些发现表明，随着物种间亲缘关系距离的增加，出现了更多的复杂染色体变异。
▲物种内旁系亲属或物种间直系亲属Ks密度分布
WGD在适应和物种分化中起着关键作用，物种内同源旁系物的Ks峰值密度分布通常表明发生了WGD事件，而物种间同源直系物的Ks峰值密度分布则表明发生了分化事件，这些分化事件类似于WGD事件，来自于它们最近的共同祖先。相应topKs通常与过去发生的WGD或分化事件的年限呈正相关。研究人员根据空心泡-空心泡的同源旁系物，在Ks密度分布中发现了一个峰值；基于掌叶覆盆子-掌叶覆盆子直向同源物的Ks密度分布也出现了大致相似的峰值。香莓、林地草莓和桃的topKs均大于黑树莓-上述其他蔷薇科植物同源物的topKs。这些结果表明，在它们的共同祖先中发生了一次WGD事件，支持了Xiang等人提出的蔷薇科成员之间共享一次全基因组复制事件的结论。
WGD事件产生的重复基因对(dgps)具有广泛的遗传和进化效应，研究人员在蔷薇基因组中鉴定出5090个因WGD而产生的dgps。剔除单基因表达为零或同时表达为零的dgps后，76.90%、73.77%、76.70%、77.69%、73.03%、75.17%、73、44%、74.67%、79.44%的WGD-dgps分别在幼根、幼叶、幼茎、花瓣、花萼、雄蕊、幼果、着色果、成熟果9个组织中表现出两个单基因之间的显著差异。这些发现表明，大多数WGD-dgps的同源进化差异导致了明显的表达差异。5090对WGD-dgps中，Ka/Ks值大于1的53对(1.04%)表现为强正选择；Ka/Ks值在0.5~1.0之间的298对(5.85%)表现为弱正选择；然而，3822对(75.09%)对的Ka/Ks值小于0.5，表明它们经历了负选择。这些结果表明，纯化选择导致有害突变体的过滤是WGD-dgp的主要进化驱动因素。
▲不同时期空心泡果实花青素含量差异显著
先前的研究表明，空心泡中含有丰富的花青素，特别是花青素和天竺葵素。利用UPLC-MS/MS广泛靶向代谢物谱分析方法，测定了9种不同时期浆果中1330种代谢物的含量，包括121种氨基酸及其衍生物、248种酚酸、241种黄酮类、78种生物碱、151种萜类和有机酸。在黄酮类化合物中，不同阶段的九个浆果中检测到17种花青素：幼果(N1)阶段三个，着色(N2)阶段三个，成熟(N3)阶段三个。研究结果表明，花青素主要是在成熟期产生的，其中的主要成分为天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-[6-O-丙二酰基]-葡萄糖苷。
共有23,997个基因在空心泡果实中不同水平表达。根据KEGG注释，共鉴定出了11个结构基因参与“花青素生物合成”途径，还鉴定出了22个结构基因参与了“类黄酮生物合成”过程，在花青素生物合成过程中发挥重要的上游作用。在这33个结构基因中，RrBZ1、RrBZ1、RrF3H、RrDFR、RrCHS、RrCHS、RrCHI和RrANS在浆果组织中表达量相对较高，研究人员推测这8个基因是参与空心泡花青素生物合成的主要基因。共有33个结构基因在空心泡的花、叶和根组织中表达，但没有一个结构基因只在浆果中表达，这一发现表明花青素代谢发生在空心泡的各个组织中，而不仅仅局限于浆果。
上述33个结构基因可归类为25个家族，其中只有一个基因家族(OG0002772)参与了用于比较的7个蔷薇科物种基因组中基因家族的扩增/构建。这一结果为这些结构基因在蔷薇科中具有进化保守性提供了证据。在少数家族中观察到基因重复事件，包括编码RrBZ1和RrUGT79B1的家族。这些基因家族的系统发育分析表明，RrBZ1-dgp起源于WGD事件，而RrUGT79B1-dgp起源于悬钩子属谱系特异性重复事件。然而，所有这些dgps在浆果中表达不同水平的旁系同源物，揭示了不同的进化命运，从而增加了花青素生物合成和调控的复杂性。
▲花青素生物合成相关结构基因的表达与调控
为了探究空心泡浆果中花青素生物合成调控的分子机制，研究人员对浆果幼龄期和成熟期的转录组和代谢组进行了相关性分析。如前文所述，成熟浆果中发现的主要花青素——天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-[6-O-丙二酰基]-葡萄糖苷被鉴定为显著差异积累代谢物(DAMs)，有11个结构基因被鉴定为差异表达基因(DEGs)。其中，RrBZ1、RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS与2个DAMs的积累呈正相关；而RrBZ1、RrUGT75C1和RrUGT79B1与这2个DAMs呈负相关；编码属于MYB、bHLH、AP2、bZIP、NAC和TCP 家族的转录因子的几个DEGs的表达与一个或多个上述结构基因和两个DAMs显著正相关或负相关。这些发现表明转录因子广泛参与了空心泡花青素生物合成的调控。此外，还通过PPI分析了蛋白与蛋白的相互作用。这些结果表明，空心泡花青素的合成受RNA甲基化、结构基因编码蛋白和转录因子的相互作用调控。
