文献集锦 | （超超超详细！建议收藏）CELL重磅综述：CRISPR基因组编辑技术的过去、现在和未来
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近期，苏黎世大学生物化学系在Cell上发表了研究成果，讨论了CRISPR基因编辑技术在研究和治疗方面的现状，重点介绍了其局限性以及近年来为解决局限性而开发的技术创新，总结了基因编辑在人类健康和治疗领域的应用现状，还概述了未来可能影响深远的基因编辑技术及其应用的潜在发展。
文章题目
Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies
第一作者：Martin Pacesa, Oana Pelea, Martin Jinek
通讯作者：Martin Jinek
通讯单位：苏黎世大学生物化学系
杂志：Cell
影响因子：64.5/Q1
文章链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.042
过去
历史背景
基因组编辑最初起源于真核生物DNA修复领域的进步。20世纪90年代早期，利用I-SceI等归巢内切酶进行的开创性研究表明，在哺乳动物细胞中诱导靶向双链断裂(DSB)可刺激靶位点的同源重组，这确立了使用产生DSB的核酸酶进行基因组编辑的概念。
由于需要能识别真核生物基因组中单个位点的长识别位点的多种核酸酶，开发了基于非特异性DNA内切酶与序列特异性DNA结合模块串联阵列的复杂融合工程核酸酶。最初是21世纪初引入的锌指核酸酶(ZFNs)，后来是2010年至2011年引入的转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)，这些发展为基因组编辑奠定了基础，但ZFNs和TALENs的设计和生成过程十分繁琐复杂，限制了它们的使用。RNA引导的CRISPR相关(Cas)核酸酶，由于其编程简单、特异性和多功能性，其发现和发展标志着革命性的转变。
2007年，原核生物CRISPR-Cas系统被证明可以作为适应性基因组防御机制，识别和靶向与病毒(噬菌体)和其他可移动遗传元件相关的外源核酸在这些系统中，入侵DNA片段被获取并存储在重复阵列中，其转录和随后的加工产生CRISPR RNA (crRNA)。crRNA具有分子向导的功能，可对由Cas蛋白组成的分子机制进行编程，以识别入侵的核酸并将其作为目标进行破坏。
随后的研究表明，所谓的II型CRISPR-Cas系统位点特异性地切割噬菌体DNA，其活性依赖于蛋白质Cas9，另外一种RNA成分tracrRNA，对crRNA的成熟至关重要。2012年发表的生化研究表明，Cas9是一种DNA切割内切酶，其特异性由由crRNA和tracrRNA组成的双RNA引导结构决定。通过将tracrRNA和crRNA整合到sgRNA中，进一步简化了CRISPR-Cas9系统，从而提供了完全可编程的单核酸酶——向导RNA设计。这成为CRISPR基因组编辑技术发展的基础，通过设计具有匹配序列的sgRNA，可以将Cas9靶向到特定的基因组位点。RNA引导Cas9 DNA切割活性的发现引发了一场将其重新用于基因组编辑的竞赛，在2013年初发表的几项研究中达到高潮，这些研究报告称，在真核细胞中表达Cas9和特定sgRNA可在目标基因组位点进行基因修饰。
基于CRISPR核酸酶的基因组编辑
CRISPR-Cas核酸酶产生位点特异性双链DNA断裂的可编程性使其能够快速适应基因组编辑技术。SpCas9是第一个被重新用于基因组编辑的Cas核酸酶，由于其固有的高活性和特异性，它仍然是使用最广泛的基因编辑器。Cas9与crRNA-tracrRNA复合物或sgRNA引导物结合形成活性核酸酶。为了将Cas9核酸酶引导到感兴趣的基因组位点，可以改变crRNA 5'端的2'-nt引导序列，使其能够与DNA靶点进行碱基配对。靶结合还依赖于位于DNA非靶链(NTS)上原间隔序列邻近基序(PAM)的存在(如图1)。CRISPR基因组编辑依靠RNA引导的核酸酶如Cas9和Cas12a进行位点特异性靶DNA的识别和切割。
Cas9使用由crRNA-tracrRNA对或sgRNA组成的双向导RNA，而Cas12a仅使用crRNA进行编程。靶DNA识别依赖于与引导RNA间隔序列的互补性以及PAM的存在。Cas9识别NGG PAM，而Cas12a需要TTTV PAM。结合靶后，核酸酶催化DNA切割，产生DNA双链断裂(DSB)。DSB修复通过细胞DNA修复途径导致引入遗传修饰(编辑)。末端连接途径导致短indels，而使用外源DNA修复模板的同源定向修复(HDR)可用于设计精确的修饰。
紧靠目标地点的下游，对PAM的初始识别会导致靶DNA的局部解旋，而引导RNA碱基与DNA的靶链(TS)以5'-3'的方向从靶位点的PAM-近端开始配对，触发Cas9的构象变化，导致核酸酶结构域激活。Cas9随后在PAM序列上游3个核苷酸处切割双链DNA(dsDNA)底物，产生钝性末端或单核苷酸悬垂的dsbDSB。DSB的形成是由Cas9 HNH和RuvC结构域催化的，它们分别切割TS和NTS。任意一个核酸酶结构域的选择性失活可将Cas9转化为RNA引导的缺口酶，而两个结构域失活可产生RNA引导的DNA结合蛋白，该蛋白可作为将融合蛋白递送到特定基因组位点的平台。
Cas12a是一种源自V型CRISPR-Cas系统的Cas核酸酶，不需要tracerRNA进行激活，在Cas9之后几年被发现，同样被重新用于基因组编辑。Cas12a已被证明是一种高效核酸酶，能够进行精确基因编辑，具有与Cas9互补的特性和功能，其反式核酸酶活性也被用于序列特异性核酸检测。
传统的基因组编辑方法依赖于在基因组中引入特定位点的双链DNA断裂，并通过内源性细胞DNA修复途径修复它们(图1)。Cas9或Cas12a酶产生的DSB通常通过末端连接途径(易出错)或精确HDR机制进行修复。Cas9诱导的DSBs末端连接修复产生的编辑结果具有可重复性，且依赖于局部序列上下文，包括NHEJ引起的单核苷酸插入或小缺失，以及MMEJ介导的缺失。相反，HDR是一种精确的DSB修复途径，它依赖于同源DNA分子的存在来指导修复结果。虽然这种方法原则上可以实现核苷酸的精确编辑，但由于HDR需要修复因子，而这些因子通常只在细胞周期的S期和G2期表达，故HDR大多只在活跃分裂的细胞中有效。因此，HDR结果的效率取决于修复模板的类型、递送方法、细胞类型、局部染色质背景等因素，这些因素会影响DNA修复途径的选择，从而优先增强HDR，抑制末端连接修复。
▲图1：CRISPR基因组编辑的分子原理
CRISPR基因组编辑的局限性
CRISPR-Cas系统作为简单有效的可编程基因编辑工具，极大地推动了许多领域的基础和应用研究，为靶向基因治疗和各种生物技术应用的发展奠定了基础。然而，高度进化的生物防御系统的功能特征与精确基因组编辑工具功能的预期有所不同。因此，第一代基于CRISPR的基因编辑工具的应用潜力受到几个关键因素的限制，主要是特异性、靶向范围以及需要依靠内源性DSB修复机制来实现基因组编辑(图2)。此外，CRISPR组分的递送受到递送载体和靶细胞或生物体的特定限制。
CRISPR-Cas系统在一定程度上容忍引导RNA和靶标之间的不匹配，这可能是需要对抗噬菌体高突变率的进化结果。然而，基因组工程应用却不希望出现这种特性，因为除了预定的目标位点外，它还可能导致基因组中其他地方部分互补的非目标位点被靶向和编辑。
许多研究都证明了Cas9的脱靶活性，这些研究表明，Cas9能以一种依赖于导向的方式容忍导向-靶异质双链中数量可观、种类繁多的核苷酸错配，脱靶的范围可以从包含单个碱基错配的位点到包含多个连续错配的靶标，甚至是核苷酸插入或缺失。尽管Cas9具有错配耐受性，但由于Cas9的DNA结合和切割机制中固有的检查点，大多数潜在的脱靶位点仅仅被结合，并不会导致dsDNA的切割和编辑。
此外，脱靶分析研究表明，与分离的基因组DNA相比，体内脱靶切割事件的频率始终较低，这表明包括基因组结构在内的其他因素可能控制细胞中Cas9的编辑活性。然而，在基因组内多个位点同时发生脱靶切割可能最终导致基因组重排，如缺失、倒位或染色体易位，并引发DNA损伤和应激反应途径。脱靶编辑仍然是治疗应用的一个主要问题，并促使科研人员努力开发强大而敏感的方法来预测和检测脱靶编辑，并通过分子工程提高CRISPR基因组编辑器的特异性。
靶向范围：PAM要求
CRISPR核酸酶的DNA结合机制将其靶向范围限制在PAM序列两侧的基因组靶点上。SpCas9是应用最广泛的基因组编辑核酸酶，虽然其NGG PAM理论上平均每8个核苷酸就能找到一个合适的靶位，但由于高A/T含量，SpCas9的一些基因组区域不容易被靶向。目前已发现并采用了许多具有其他PAM特异性的天然Cas9同源物来进行基因组编辑，但其中许多对PAM的要求更为严格。尽管这提供了更高靶向特异性并减少了脱靶活性，但往往会导致DNA的裂解和编辑效率不达标。Cas12a核酸酶识别富含T的PAM序列(典型的是TTTV)，但它们的靶向范围同样受到限制。为了克服PAM要求的限制，近年来已经开发了许多具有修改或放宽PAM特异性的人工Cas9变体。虽然这些极大扩展了可靶向位点的范围，但放宽PAM靶向性会导致靶向特异性大大降低，增加了脱靶效应的可能性，并且由于在脱靶位点螯合而降低了靶编辑效率。
▲图2：CRISPR基因组编辑的局限性
控制编辑结果
利用靶向核酸酶在基因组内产生DSBs可显著提高哺乳动物细胞中HDR的发生率，尽管如此，HDR的使用仅限于分裂细胞，并且由于末端连接途径同时进行编辑，通常会产生异等位基因编辑结果。此外，在预期的基因组靶位点进行的编辑准确性也受到其他不利结果的限制，包括大量缺失和染色体重排，甚至染色体丢失。因此，许多研究都致力于开发控制DNA修复结果的方法，特别是刺激HDR修复的速度，从而提高敲入(插入)突变的效率。
最重要的是，研究表明修复模板的选择及其传递对HDR的效率有很大影响。增强HDR的方法包括使用非对称ssODN模板，引入沉默突变以阻断靶位点的反复切割，或将修复供体模板系于断裂位点。此外，对细胞周期的操纵结合预组装的Cas9核糖核蛋白颗粒的递送也会导致HDR增强。细胞周期同步可以通过使用小分子抑制剂来暂时减缓S期或通过增加G2/M期细胞的比例来实现。其他方法侧重于通过抑制关键的NHEJ因子，将NHEJ和HDR途径选择之间的平衡转向HDR。
类似地，Cas9与参与HDR的修复因子(如Rad51、Rad52或Mre11)直接结合可大大提高基因敲入突变率。在人类原代T细胞中，通过与小分子DNA修复调节剂联合使用，设计工程化的ssDNA修复模板，形成Cas9-RNPs可识别的dsDNA末端，可以实现超过80%-90%的HDR编辑效率。最近的研究表明，利用二级引导RNA重靶向NHEJ编辑副产物可以提高HDR的效率。尽管取得了这些进展，但使用同源模板引入敲入基因突变，特别是长插入突变的过程仍然具有挑战性。有丝分裂后终末分化细胞(如神经元)的HDR水平并不明显，因此，使用基于典型DSB的策略进行精确编辑在很大程度上仍然难以奏效。这促使人们开发出不依赖DSB、无需HDR的基因组编辑技术，包括碱基编辑和引物编辑，以及最近基于CRISPR的重组酶和转座酶。
递送
基因编辑器的靶向递送仍然是大多数体内和体外基因编辑应用的限制因素。特别是，安全、特异和高效地将CRISPR组分递送到靶细胞是成功治疗性基因组编辑的先决条件。CRISPR组分及其递送载体的免疫原性也是体内治疗应用的一个问题。已经在人类中发现了预先存在的抗Cas9抗体和反应性T细胞，并且在犬类和非人灵长类动物疾病模型中，Cas9免疫与治疗结果受损有关。目前已经提出了几种克服原有免疫的策略，如通过工程化Cas9消除免疫原表位、调节免疫反应以及限制Cas9的表达时间。Cas9/Cas12a酶及其引导RNA可以根据靶细胞类型或生物体以多种形式递送。
对于大多数体外(即离体)应用于培养细胞，电穿孔(核转染)或脂质体介导的转染由于其高效率仍然是最广泛使用的传递方式。Cas9和引导RNA成分可以作为RNA、质粒DNA或体外重组核糖核蛋白(RNP)复合物递送，基于RNP的瞬时传递已成为体外治疗应用中基因编辑的首选，因为从质粒中长期表达Cas9复合体可导致高脱靶编辑率和随机质粒整合。
对于许多模式生物的种系基因组编辑，Cas9 RNPs或mRNA通常通过显微注射或电穿孔传递。CRISPR-Cas9在哺乳动物细胞中的体内传递通常是通过病毒载体实现的。腺病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)都可以被设计成用基因编辑模块替换载体中的病毒基因。AAV因其具有低免疫原性、高转导效率和多样细胞亲和性，仍然是体内递送的首选载体。然而，AAV是相对较小的病毒，其cargo packaging能力有限。因此，除非使用超小型启动子，否则很难将编码SpCas9及其sgRNA的基因包装到单个AAV载体中。为了克服这一限制，科研人员一直试图改造更小的Cas9同源物和紧凑型Cas12家族酶。最后，Cas9 mRNA与合成的引导RNA或体外重组的RNP粒子结合后，可通过非病毒方法(LNPs)在体内输送到细胞中。这些方法的优点是它们通常比基于病毒的载体更安全，免疫原性更低。LNPs通过内吞作用内化，其内容物要么逃出内质体进入细胞核，要么被溶酶体降解，从而限制了其效率。最近出现的新型LNP配方提高了组织特异性和器官靶向的效率。总之，利用脂质纳米颗粒递送Cas9和其他基因组编辑器已成功应用于多种细胞类型和生物体。
现在
自从首次展示基于CRISPR的基因编辑以来，该领域以前所未有的速度发展。基于Cas9和Cas12a核酸酶的第一代DSB依赖性基因组编辑器的能力已经通过不断创新得到增强，不仅提高了这些工具的多功能性，还完善了其精确性，并最大限度地减少了意外编辑后果。然而，由于脱靶编辑活性和靶DSB潜在的基因毒性作用(包括p53的诱导)，对其安全性的担忧仍然存在。
为了减少意外编辑的发生，已经探索了许多方法来精确控制CRISPR基因组编辑器的时空，如使用天然存在的抗CRISPR蛋白抑制剂进行组织限制性编辑。对DSB遗传毒性的担忧和解决HDR低效率的需要进一步推动了“第二代”CRISPR技术的发展，这些技术介导基因组编辑，而不依赖于DBS的形成和HDR，主要是碱基编辑器(BEs)和引物编辑器(PEs)。目前，可用技术的不断拓展(图3)为基因组编辑提供了更有针对性的方法，特定技术特别适合某些类型的编辑或传递模式。尽管基因组编辑工具包中的这些新增功能大大有助于解决与典型CRISPR基因组编辑相关的诸多限制，但它们在活性、特异性和传递方面仍有局限。
Cas9以外的核酸酶
Cas9作为基因组编辑核酸酶的初步开发激发了后续研究，旨在鉴定新的天然存在的具有基因组工程潜在应用价值的Cas9酶。由于这些努力，近年来已经发现了十几种新的进化多样的RNA引导核酸酶，并将其用于基因组编辑，如Cas13、Cas12a2和Cas12g等，但每种Cas核酸酶都有其自身局限性，包括PAM靶向性受限，不同的体内活性和脱靶特征或潜在的免疫原性。然而，多种酶的可用性有助于采取更有针对性的基因组编辑方法，为各种应用提供灵活性。许多这些酶与其引导RNA的正交性在多重应用方面能够发挥很大价值。
▲当前的CRISPR编辑技术
高保真Cas9变体
为了解决脱靶活性的问题，利用两种互补的方法开发了特异性更高的SpCas9工程变体：第一种是基于结构合理设计保真度增强突变，其原理是消除Cas9蛋白与结合DNA靶点之间的特异性接触，使Cas9引导的RNA复合物对底物DNA中的错配更敏感，从而降低脱靶结合和裂解的概率。对这些变体进行的生物物理和生物化学研究表明，这些突变大大降低了DNA的裂解速度，从而促进了脱靶释放；第二种方法是利用定向进化方法来选择减少脱靶编辑的突变。类似的工作还包括设计其他Cas9和Cas12a酶的高保真变体。尽管迄今为止开发的高保真变体比野生型酶的特异性大大提高，但它们的效率在不同的DNA靶标和应用中会有所不同。此外，由于每个靶标都与一组独特的非靶标相关联，其编辑频率各不相同，因此目前可用的高保真核酸酶变体都不可能普遍适用。
向导RNA修饰
对基因组编辑器的引导RNA进行工程改造以提高特异性，为使用高保真核酸酶突变体提供了令人信服的替代方案。此类研究的第一个重点是为Cas9使用截断的引导RNA，其中引导片段从核苷酸中截断。研究表明，这些引导RNA可显著降低SpCas9在多个位点的脱靶活性，但同时也会降低效率或引发新的脱靶位点的编辑。通过引入二级结构或非配对核苷酸对引导片段的5'端进行修饰，也被证明可以减轻脱靶识别。部分修饰已在体内显示出强大的基因编辑活性，但修饰核苷酸的效果高度依赖于位置，这与DNA片段取代类似。
PAM基因组编辑器的替代方案
为了克服Cas核酸酶依赖PAM靶位点的限制，一些研究试图通过基于结构的合理设计或定向进化，在PAM相互作用结构域中引入改变特异性的氨基酸取代，从而扩大SpCas9的PAM靶向范围。这最初导致了能够分别靶向NGAN、NGNG和NGCG PAM的VQR、EQR和VRER SpCas9变体的开发。针对非G PAMs的其他工程变体进一步放宽了SpCas9的PAM选择性。为了使CRISPR-Cas9能够访问更广泛的基因组位点，最近成功设计出了能够以NRN PAM为靶点的SpCas9变体，包括几乎“无 PAM”的Cas9设计。虽然这些变体的体内编辑活性差异很大，但它们极大扩展了Cas9的靶向潜力，简化了靶点选择，是对野生型SpCas9和其他天然衍生的Cas9同源物的补充。同样，具有宽松PAM特异性的Cas12a变体也被开发用于编辑应用。
碱基编辑
CRISPR衍生的碱基编辑器(BEs)已被开发为一种多功能技术，无需产生DSB和提供同源修复模板即可产生靶向点突变，从而在HDR缺乏的细胞中进行编辑，BEs是RuvC失活的切口酶版Cas9与核苷酸脱氨酶的模块化融合。自发明以来，最初的CBE和ABE编辑器经历了多次设计迭代，以提高活性并减少脱氨酶诱导的脱靶编辑量，此外还开发了 Cas12a BE。碱基编辑的范围也已扩大到A到C、A到Y和C到G的转换。
引物编辑
引物编辑是一种基于Cas9的方法，以独立于HDR的方式产生靶向点突变以及插入或缺失。引物编辑器由引物编辑pegRNA和融合蛋白构建体组成，融合蛋白构建体由带有失活HNH结构域的Cas9切口酶和工程化反转录酶(RT)结构域组成。pegRNA含有一个3'端序列延伸，与目标基因组靶点的NTS互补，并包含所需的突变；Cas9在NTS上产生一个缺口，然后与互补的pegRNA扩展序列碱基配对；然后，以pegRNA为模板，通过RT催化延伸NTS的3'端，引入突变；随后，DNA链重新断开，产生一个5'翻转中间体，该中间体经过切除和连接，将编辑固定在基因组DNA中。通过这种有针对性的链合成，可以引入长达40 bp的插入或长达80 bp的缺失，以及距离Cas9切分位点30 bp的点突变。
第一代引物编辑器的设计是将切口酶Cas9与来自Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)的野生型RT融合在一起，随后的几代引物编辑器设计通过加入具有更强热稳定性的工程化MMLV RT结构域，以及引入第二个sgRNA在非编辑链上产生切口以促进编辑在基因组DNA中的保留，提高了引物编辑效率。通过抑制DNA错配修复途径以及改善核定位、表达和DNA缺口，还实现了其他改进。此外，在pegRNA的3'端添加稳定的二级结构可抑制其降解，这已被证明可提高引物编辑的效率。
迄今为止，引物编辑已成功应用于多种生物和细胞类型。然而，根据编辑目的、目标位点序列和细胞类型的不同，引物编辑效率差异很大且往往效率很低。此外，引物编辑并不能完全避免产生靶上 DSB，从而导致意外的、潜在的基因毒性效应。为了解决这些局限性，科研人员将会继续开发性能更好的新型PE变体，包括使用pegRNA对产生更广泛编辑的系统。
转录调节：CRISPRi和CRISPRa
CRISPR技术不仅适用于基因组编辑，还能对基因表达进行瞬时操纵。催化不活跃的Cas9突变体最初用于细菌，以基因启动子为靶标，立体阻断RNA聚合酶，从而抑制RNA转录。为了抑制真核细胞中的基因表达，核酸酶活性Cas9可以与各种转录和表观遗传调节剂融合，并靶向活跃转录基因的启动子区域。由此产生的方法被称为CRISPR干扰(CRISPRi)，可以高效敲除基因表达，替代基于小干扰RNA(siRNA)的RNA干扰。与此类似，核酸酶失活的Cas9蛋白融合体也可以通过直接招募转录激活因子或调节染色质状态来激活特定基因的表达。
CRISPR激活(CRISPRa)是通过将dCas9与转录激活结构域融合来实现的。另外，与组蛋白修饰酶融合，也可以在特定位点改变表观遗传标记，诱导活跃的染色质状态，从而驱动基因表达。这种方法很容易用于全基因组功能缺失(CRISPRi)或功能增益(CRISPRa)筛选。然而，由于Cas9的DNA结合通常比裂解更杂乱，CRISPR引导的转录调控存在相当大的脱靶活性。
靶向RNA沉默和修饰从VI型CRISPR-Cas系统中发现RNA引导的ssRNA靶 Cas13酶后，开发出了用于靶向RNA沉默、编辑和修饰的分子工具。由于RNA编辑是瞬时的，因此在某些情况下，转录组编辑有可能成为基因组编辑的一种有吸引力的替代方法,如在疼痛、炎症或病毒感染等急性疾病中，瞬时RNA编辑可以提供暂时的治疗效果，而不会带来永久性的基因改变。目前的RNA编辑方法是将核酸酶活性dCas13蛋白与作用于RNA的ADAR融合，催化目标RNA分子内的腺苷脱氨，生成肌苷碱基。Cas13引导RNA与目标RNA杂交后会产生ADAR酶所需的dsRNA底物，由此产生的肌苷能有效地与胞嘧啶进行碱基配对，因此在翻译过程中被读出为鸟苷，从而在mRNA中引入密码子变化，相当于A到G的转换。随后的蛋白质工程开发出了一种ADAR2变体，它能够在Cas13引导下在RNA中进行C到U的转换。利用dCas13蛋白融合体对RNA进行靶向修饰的概念已进一步扩展到开发“epitranscriptomic editors”，该编辑器能够在目标mRNA中特异性安装m6A修饰位点。
目前在基础研究和人类医学中的应用
CRISPR基因组编辑技术的进步带来了大量应用，这些应用在增进人类健康方面具有巨大潜力(图4)。首先，CRISPR改变了基因研究，使科学家能够在各种实验模型中模拟致病突变，创建大规模的全基因组筛选方法，并开发用于研究正常发育和疾病进展的合成基因记录装置；CRISPR技术还被用于制定消灭人类病毒或细菌病原体的策略，后者是通过开发工程噬菌体实现的；CRISPR基因组编辑技术在过去十年的发展中开发出了多种治疗遗传疾病的方法，其中有几种已经从基于细胞和动物模型的临床前研究进入人体临床试验阶段，包括体内和体外治疗矫正策略。体内治疗矫正方法涉及将基因编辑元件输送到人体内受影响的组织；体外疗法则是收集患者的细胞，在实验室中对其进行编辑，然后将编辑过的细胞移植回患者体内。CRISPR体外编辑技术还能产生自体和异体基因组修饰细胞疗法，主要用于癌症免疫疗法。
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反向遗传学：细胞、器官和动物的疾病建模
确定导致人类疾病的特定等位基因是基因研究的重点，下一代测序技术提高了精确定位可能导致这些疾病变异的能力。然而，要最终确定特定变异是遗传病的致病因素，必须通过反向遗传方法进行实验验证。CRISPR基因组编辑技术尤其有助于生成基于细胞的同源疾病模型，使研究人员能够将特定突变导入野生型细胞，或反过来将患者衍生细胞中的突变还原为野生型，从而生成对照细胞系。Cas9在人类细胞中的基因组编辑活性得到证实后不久，CRISPR基因组编辑技术就被广泛应用于以患者衍生细胞、器官组织或模式生物为对象的疾病表型建模研究中。
人类诱导多能干细胞(iPSC)为疾病表型建模提供了一种强大的方法，通过编辑这些细胞并引导它们分化成受疾病影响的特定细胞类型，研究人员可以在相关的细胞环境中研究疾病。基于CRISPR的iPSC模型对于影响大脑等无法进入的组织或器官的疾病尤其有价值。CRISPR改造的器官组织可以模拟受疾病影响器官的复杂性，通过对肿瘤抑制基因或致癌基因的突变进行工程改造，已被用于模拟癌症，CRISPR改造的模式生物也有助于建立特定突变与人类遗传疾病之间的联系。事实证明，这些模型在复制罕见的人类发育障碍方面尤为成功。啮齿类动物(主要是小鼠)是最常用的动物疾病模型，CRISPR编辑技术促进了多重或条件基因敲除或敲入的产生，包括非人灵长类动物、猪和狗在内的大型动物模型在生理和遗传方面与人类更为相似。
灵长类动物的寿命较长，因此对研究衰老和慢性疾病的进展非常有价值，更接近人类随着时间推移而出现的病症。CRISPR改造的非人灵长类动物让人们对发育过程有了更深入的了解。同样，人类心血管疾病也成功在CRISPR改造的猪或狗身上建模。此外，生成啮齿动物和大型动物模型的能力对于验证疾病相关变异和了解疾病机理至关重要，因为这些模型为旨在治疗此类疾病的治疗干预措施的临床前评估提供了重要平台。CRISPR基因组编辑技术可以生成大型动物模型，而无需维持庞大的繁殖群体，从而带来巨大的经济和动物福利效益。
CRISPR基因组编辑技术的一大优势是，它可以使用不同的引导RNA同时针对多个基因组位点进行多重编辑。这种方法能够生成携带一种以上基因突变的动物模型，并通过使用不同sgRNA序列靶向单个细胞中多达62个独特的基因位点，多重灭活内源性逆转录病毒。除了模拟导致疾病的基因突变外，利用CRISPR技术进行的多重基因组编辑还改变了生物技术的其他领域，特别是用于农业应用的植物工程和用于工业生物生产的微生物代谢途径工程。
正向遗传学：CRISPR筛选、谱系追踪和分子记录仪
全基因组基因敲除筛选等正向遗传学方法是研究健康和疾病中生物功能的强大工具。借助基因组编辑技术的不断进步，CRISPR筛选可以对细胞内成千上万的单个基因和非编码基因组元件进行系统性干扰，从而有助于鉴定与特定生物通路及其相互作用相关的基因。在这些高通量筛选中，通常通过慢病毒载体池转导，将引导RNA文库和Cas酶一起送入细胞，确保每个细胞都能接收到不同的sgRNA。在进行基于细胞存活或读出的选择后，利用新一代测序来确定哪些引导RNA从细胞群中富集或掉落，从而确定与特定表型相关的靶基因。这种通用方法已适应于不同类型的CRISPR技术，如用于基因敲除筛选的CRISPR核酸酶、CRISPRi、CRISPRa、BE、PE以及Cas13，从而可以研究多种基因修饰。
BEs可以有效引入点突变，已成为功能缺失和功能增益遗传变异筛选的有力工具。CRISPR筛选与单细胞组学方法的结合大大提高了研究基因功能的能力。PERTURB-seq、CRISP-seq、CROPseq和Mosaic-seq等方法利用单细胞RNA测序来跟踪单个细胞中的sgRNA，同时监测CRISPR诱导扰动后基因表达的全谱变化，这些方法的进一步改进使得人们能够直接研究体内基因的功能，如分析与小鼠大脑神经发育障碍有关的基因。此外，这些方法还与空间分辨单细胞RNA测序相结合，剖析肿瘤中癌细胞与免疫细胞之间错综复杂的相互作用，或与单细胞质谱联用，进行详细的蛋白质表达谱分析。
除了全基因组筛选之外，CRISPR基因组编辑工具还促进了谱系追踪方法的发展，从而能够监测细胞增殖和重建细胞系树；CRISPR基因组编辑技术还使合成记忆装置得以发展，将瞬时分子事件的信息记录到DNA条形码中，包括转录历史、特定顺式调控元件活性或暴露于某些环境因素的信息。这种分子记录仪的功能是将特定分子事件与生成独特的、可检测的基因组编码编辑联系起来，便于跟踪这些事件的存在、强度、持续时间和相对时间，这项技术的应用已扩展到小鼠肠道微生物组的体内研究中。
体外治疗应用
基于CRISPR技术对患者体外细胞进行基因组编辑，然后进行扩增和再移植，是治疗血细胞遗传疾病的有力策略，成功开发出治疗遗传性血红蛋白病的方法就是一个很好的例子。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是指在体外对T细胞进行改造，使其分别针对B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤中的CD19或B细胞成熟抗原(BCMA)等癌细胞标记物，从而在输注到患者体内后消灭癌细胞。在目前获批的自体CAR-T细胞疗法中，CAR编码基因是通过慢病毒载体转导随机插入基因组的。为了解决复杂易失败这一局限性，通过CRISPR编辑供体来源的T细胞生成的异体CAR-T细胞可以提供更强的功能、简化生产流程并加强质量控制。目前，针对一系列血癌的CRISPR编辑CAR-T细胞疗法正在进行多项临床试验。
未来基因组疗法的一个潜在强力策略是将体内外CRISPR基因组编辑与iPSC技术相结合。 最近开发的一种用于控制Ⅰ型糖尿病的方法涉及iPSC基因组工程，将其分化为胰腺内胚层细胞，并封装在生物相容性装置中植入患者体内，以产生对控制Ⅰ型糖尿病至关重要的胰岛素。在这些复杂的方案中，CRISPR编辑可用于删除一组基因以促进移植物的接受，保护工程细胞免受压力，并优化胰岛素的产生。CRISPR基因编辑技术还被用于动物异种移植研究，如在猪肺异种移植中防止免疫排斥的靶向基因修饰提高了非人类灵长类动物受体的移植物接受度。
历史背景
与体内外策略不同，体内治疗性基因编辑涉及通过局部或全身给药将CRISPR基因组编辑器直接施用于体内受影响的组织。一些原理验证的临床前研究已经成功证明了体内治疗性基因组编辑，特别是通过使用AAV9载体向肌肉定向递送Cas9和引导RNA，在杜氏肌营养不良症动物模型中恢复肌营养不良蛋白的表达，以及通过AAV9介导的CBE递送到大脑来挽救该疾病小鼠模型中的脊髓性肌萎缩。另一种早期方法是将CRISPR组分直接注入眼球，由组织特异性启动子驱动的Cas9与引导RNA一起被包装在AAV5载体中，通过视网膜下注射输送到受影响的区域，从而恢复小鼠和非人灵长类动物的视力。
肝脏是体内基因编辑的绝佳靶点，因为其不连续的毛细血管结构有利于通过低密度脂蛋白(LDL)受体途径吸收系统给药的脂质纳米颗粒。转甲状腺素蛋白(TTR)淀粉样变性是一种因错误折叠的TTR在心脏或神经系统中有害堆积而引起的疾病，由于TTR主要在肝脏中产生，一种有效策略是利用LNP介导的Cas9 mRNA和合成sgRNA在肝脏中敲除该基因。在一项临床试验中，这种方法显著降低了血清中的TTR水平，是首个成功的体内系统递送CRISPR基因疗法案例。
临床试验还在探索家族性高胆固醇血症的治疗方法，这种疾病的特点是血液中低密度脂蛋白胆固醇水平较高。其中一种创新方法涉及基于LNP的CRISPR ABEs系统性递送，以肝脏中的PCSK9基因为靶点，旨在通过敲除该基因来降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇。在非人灵长类动物中，这种方法显著降低了PCSK9水平和血清低密度脂蛋白胆固醇，而不影响生殖组织，为一期临床试验创造了条件。一种增强型治疗策略是将ABE mRNA与PCSK9特异性sgRNA一起封装在LNPs中，这种LNPs由多价GalNAc配体独特配制而成，可提高低密度脂蛋白受体缺乏患者肝细胞的吸收率。
未来
新兴的第三代工具和技术(图 5)包括最近发现的紧凑型RNA引导核酸酶，可用于基于DSB的编辑，也可作为RNA引导的DNA结合平台，用于BE和PE等其他基因组编辑方式。长DNA遗传序列的插入，尤其是在缺乏HDR的有丝分裂后细胞中插入，仍然是基因组编辑领域的一大亟待探索的问题。
最小的祖先RNA引导核酸酶
目前寻找新型RNA引导核酸酶的主要动机是，需要具有正交引导RNA支架和靶向能力的替代酶，最好是最小尺寸，以便于构建融合蛋白(如BE和PE)，并利用病毒载体将其有效地传递到细胞。最近超小型 Cas12f 核酸酶(422个氨基酸)的开发和工程化就是个很好的例子，它通过深度突变扫描和结构引导设计增强了其体内编辑活性。研究重点是Cas9和Cas12酶的进化祖先，即IscB/IsrB117和TnpB。这些蛋白质也被统称为HEARO或OMEGA核酸酶，它们在原核生物转座元件中编码，有助于转座机制并促进转座子的保留。
事实证明，IscB和TnpB核酸酶都能在人类细胞中介导可编程基因组编辑。真核生物TnpB类蛋白Fanzor的发现也被证明能催化RNA引导的DNA切割并支持可编程基因组编辑，这突显了RNA引导的核酸酶在所有生命领域的普遍性。这些核酸酶体积小巧，有利于它们的输送，但还需要在分子工程方面进一步挖掘来提高效率以及扩大靶向范围。
▲基因组编辑的新兴技术
DNA聚合酶编辑器
在PE中，RT与Cas9切分酶融合，以部分引导RNA为模板，在目标位点RNA模板上引入修饰；与PE不同的是，目前正在探索利用DNA聚合酶在基因组中引入靶向突变的新方法。最近的一项研究表明，噬菌体衍生的DNA聚合酶可以利用phage-derived DNA模板在Cas9标记位点上引入编辑。与基于RT的引物编辑相比，这种方法避免了引导RNA分子内碱基配对的自抑制作用，可实现超过100个核苷酸的较长插入。另一种被称为“click editing”的新方法将Cas9与DNA依赖性DDP和HUH内切酶结合起来，利用HUH内切酶的生物耦联活性，将“click DNA”模板共价连接到HUH-nCas9-DDP蛋白融合体上。这种方法不仅能精确编辑基因组，减少嵌合，还能避免意外插入。
CRISPR 引导的重组酶和转座子
依靠模板定向修复dsDNA断裂的基因组编辑主要局限于HDR活跃的增殖细胞，在有丝分裂后的细胞中不能有效发挥作用。此外，HDR介导的插入效率与插入大小成反比，严重限制了向基因组中插入长DNA片段或整个新基因的能力。最近，PE的功能通过与丝氨酸重组酶/整合酶相结合的方法得到了扩展，即由引物编辑器介导的重组酶识别位点的安装可使重组酶随后插入多千位碱基DNA序列。对新型重组酶的系统发现和特征描述将有助于进一步优化这些方法，以提高其效率和特异性。
转座子能够自主催化大DNA片段插入，而不依赖于DSB的产生和修复。之前的方法虽然提高了目标位点附近的转座事件发生频率，但由于总体效率低，且脱靶转座事件发生频率高，目前还无法将其作为靶向基因插入技术广泛使用。与工程化的Cas9转座酶融合不同，CRISPR相关转座子(CAST)系统是自然发生的类似Tn7转座元件，它们共同采用I型或V型CRISPR-Cas系统作为靶向模块，介导RNA引导的DNA转座。
Retroelement-based编辑
与CAST不同，逆转录酶元，特别是非长末端重复(non-LTR)逆转录转座子，代表了一种新兴的方法，可实现长DNA序列的可编程插入，并可能具有更高的效率和特异性。与PE一样，逆转录子也是通过目标引导反转录(TPRT)来催化DNA插入的，这种机制包括对目标DNA进行切口，并利用暴露的3'端切口来刺激逆转录子RNA的反转录。最近对家蚕R2元件的结构研究揭示了其目标DNA识别和TPRT启动机制。利用Cas9缺口酶，可以将逆转录元件重新定位到非天然DNA序列上，从而为逆转录元件的定向DNA插入提供了一种可能策略。与其他方法相比，逆转录因子在递送更大基因大小的DNA有效载荷方面可能具有独特优势。不过，插入的精确性和脱靶效应的控制还需要进一步验证。此外，逆转录酶介导的整合效率可能会因靶细胞类型和基因组环境的不同而有所差异，从而限制了其普遍适用性。
表观基因组编辑
引入永久性基因修饰会带来巨大风险，如意外突变，并引发种系基因组编辑方面的伦理问题。基于CRISPR的表观基因组编辑——引入靶向性表观遗传修饰，既不影响种系DNA，又能在无数代细胞中持续存在——提供了一种前景广阔的替代方法。通过将DNA和组蛋白修饰酶与核酸酶失活的Cas9融合，可以在特定基因组位点重组染色质，从而诱导或抑制目标基因的表达。
最近建立的一种被称为CRISPRoff的表观基因组编辑器方法利用DNA甲基转移酶与KRAB转录抑制结构域结合，在增殖细胞中高效、持续地沉默基因表达多代。CRISPRon是一种结合了Cas9、DNA去甲基化酶TET1和转录激活结构域的多组分编辑器，可以逆转沉默，重新激活基因表达。乙酰化是表观遗传组蛋白修饰的另一种形式，HAT和HDAC可用于修饰染色质，从而分别激活或抑制基因表达。然而，某些限制因素依然存在。由于Cas9可仅根据引导RNA的种子序列瞬时结合到非目标位点，组蛋白和染色质修饰剂可能会无意中影响非目标基因的转录状态。此外，这些表观遗传变化的长期影响和稳定性仍有待更详细的深入研究，以充分了解其后果，尤其是在复杂疾病的背景下。
RNA编辑
与表观基因组编辑一样，由于mRNA在细胞内的寿命有限，直接在mRNA中引入靶向突变可能比编辑DNA更安全。RNA编辑方法不断发展，对编辑结果提供了更精确、更多变的控制。Cas7-11系统是一种新型单蛋白CRISPR-Cas效应器，它利用引导RNA来切割靶RNA。与Cas13a介导的基因敲除方法相比，该系统经过重新设计，在哺乳动物细胞中以最小的脱靶活性敲除转录本，而且明显没有附带的切割活性。此外，最近还报道了一种CRISPR介导的长RNA转录本转录新方法，通过利用RNA靶向Cas13酶与转接RNA的结合，该技术可以替换或插入哺乳动物mRNA转录本中的大片段。这些新技术对治疗开发具有重要意义，特别是对可通过瞬时基因校正来治疗的遗传疾病。
新型递送方式
将基因编辑器复合物高效、精确地递送到靶细胞或器官中，仍然是基因组编辑最重要的因素之一，目前正在开发一系列策略以提高递送效率，最大限度降低基于CRISPR的基因组编辑器的潜在免疫原性。首先，最近开发出的新型LNP配方可实现组织特异性靶向，从而为包装和递送CRISPR组分提供了一种多功能方法，可提高细胞吸收率并减少脱靶编辑。细胞穿膜肽作为CRISPR酶的一种递送方法也显示出相当大的潜力，特别是在编辑人类原代淋巴细胞、神经细胞和气道上皮细胞方面。细菌收缩注射系统经过重新设计，可以高效地瞬时和特异性输送蛋白质组分，包括基因组编辑核酸酶。模拟病毒但不含病毒遗传物质的工程病毒样颗粒已成为病毒载体在体内应用的强大替代品。
另一项有前途的技术是基于内源性病毒样颗粒的工程技术，它以真核生物基因组中编码的古老病毒为基础，有可能在减少免疫原性反应的情况下进行递送。最后，随着精确计算蛋白质设计方法的出现，科研人员正在开发全新设计的蛋白质笼，可以提供模块化策略，将基因编辑复合物递送到自然系统无法进入的生物环境中。尽管这些技术进展前景广阔，但其细胞毒性、脱靶性和免疫原性特征还需要在各种细胞类型和组织中进行严格评估。此外，其中一些方法在临床应用中的可扩展性以及开发和制造这种复杂给药系统的成本也构成了重大挑战。
人工智能
最近，人工智能(AI)和深度学习计算算法在生物科学领域的快速应用也对基因组编辑领域产生了深远影响。通过对编辑结果和效率(包括脱靶活性)进行预测建模，人工智能在提高编辑精度和效率方面取得了长足进步，这对于最大限度减少意外基因改变至关重要，尤其是在安全性和有效性至关重要的治疗应用领域。未来，人工智能方法有可能用于进一步个性化治疗应用中的基因编辑方法。通过新型计算蛋白质设计方法，人工智能还被用于设计新型、更高效和特异的核酸酶。然而，人工智能方法也面临着一系列挑战，预测模型在很大程度上依赖于训练数据的可用性和质量，而根据实验方法的不同，训练数据的可用性和质量可能是有限的，且变化很大。此外，人工智能模型的“black-box”性质使得人们无法了解这些模型是如何做出决策的，从而使预测结果难以解释和令人信服。
展望
目前正在开发新兴的(第三代)CRISPR技术，以解决该领域尚未满足的两大需求：实现大型(基因大小)有效载荷的精确插入，以及通过表观基因组工程在不进行任何基因组编辑的情况下进行基因调控。这些技术和其他技术的不断进步得益于两种方法：一方面是通过挖掘元基因组发现新的分子系统，另一方面是通过合成生物学和(人工智能支持的)分子工程。
目前的发展轨迹表明，基因编辑技术领域值得进一步研究的方向包括开发特异性更强、免疫原性更低的递送载体，减少脱靶效应，加强对编辑结果的控制，提高基因组编辑的准确性和精确度。与纯粹基于蛋白质的技术相比，核酸引导系统因其可编程性和适应性，很可能在未来成为基因组编辑的核心，但应用模式可能会发生变化，有可能转向瞬时编辑方法，以最大限度降低非预期长期基因变化的风险，或转向瞬时递送，以最大限度降低基因组破坏和免疫反应。
通过体外编辑治疗SCD和b型地中海贫血症等疾病的第一代技术已被批准用于临床，而体内方法也不甘落后，因此制约未来针对各种疾病的基因组定向疗法开发的瓶颈将不再是缺乏安全、高效或精确的基因组编辑器。主要的挑战在于给药方法，尤其是血液和肝脏以外的器官以及某些体外细胞类型，体内传递方法的进步可能会极大促进CRISPR技术的应用。
此外，即使是目前可用现有方法编辑的组织和细胞，也需要更多的基础研究来确定安全的编辑靶点。因此，可以通过CRISPR治疗的疾病范围将随着新递送载体的发展和致病变异的特征及其纠正策略的发展而扩大。基于人工智能方法的兴起将使我们能够准确模拟复杂的基因组编辑环境，预测靶上和靶下编辑结果，并设计出能力更强的基因组编辑器，从而加快实施安全治疗方法的步伐。
伦理和社会影响，特别是有关人类种系基因组修改的伦理和社会影响，仍将是基因组编辑讨论的重点。对人类胚胎的研究表明，CRISPR基因组编辑技术在用于生殖目的的种系编辑方面不够安全和有效。此外，生殖系编辑的治疗作用有限，也许只能使少数人受益。尽管如此，对基因组编辑技术规范整合和责任管理达成国际共识的紧迫性怎么强调都不为过，尤其是考虑到其快速发展、不断改进和广泛应用。
总之，尽管存在挑战，CRISPR基因组编辑技术的前景依然光明。它不仅有可能推动研究突破，彻底改变人类医学，而且有可能促进农业发展，应对生态挑战，从而为人类创造更健康、更可持续的未来奠定基础。
