经典案例 | 岷江百合多组学综合研究揭示苯丙烷代谢物对镰刀菌枯萎病的防御反应机制
近期，，在Horticulture Research上发表了研究成果，利用转录组、代谢组和蛋白质组等多组学技术，探索了与抗镰刀菌枯萎病相关的代谢物及其抗菌作用。
文章题目
Integrated multi-omics investigation revealed the importance of phenylpropanoid metabolism in the defense response of Lilium regale Wilson to Fusarium wilt
第一作者：Jie Deng
通讯作者：Diqiu Liu
通讯单位：昆明理工大学生命科学与技术学院
杂志：Horticulture Research
影响因子：8.7/Q1
文章链接：
https://doi.org/10.1093/hr/uhae140
研究背景
植物在其整个生命周期中面临诸多压力，包括对其生长和生产力产生不利影响的真菌疾病。随时间推移，植物形成了独特免疫机制来对抗病原体。植物模式识别受体能检测到病原体相关的分子模式，从而触发模式触发免疫，这与质量抗性(QTR)密切相关。病原体释放效应蛋白来感染植物，但植物会产生由抗性基因编码的抗性蛋白来抵消这些效应蛋白，从而产生效应触发免疫，也称为单基因抗性或质量抗性。QTR由多个基因控制，涉及抗性相关代谢物的生物合成，被认为是植物的高级抗病机制。
代谢物在植物防御反应中起着至关重要的作用，苯丙烷、萜类化合物以及生物碱等都是有助于抗逆的次级代谢物，如肉桂醛可抑制接骨木镰孢菌的生长。以往的研究表明，利用基于正向遗传学的方法识别抗性相关基因并确定其特征，同时分析抗性相关代谢物，可以阐明QTR的分子基础。
据报道，一些TFs(包括WRKY、MYB、bHLH 和ERFs)可调节植物免疫系统中代谢物的生物合成。ERFs属于AP2/ERF超家族，根据其结合的顺式作用元件(分别为AGCCGCC和A/GCCGAC)可进一步分为ERF亚家族和CBF/DREB亚家族。在大豆中，MAPK4/MAPK6磷酸化GmERF113，从而增强GmPR1的表达并提高对大豆疫霉的抗性；栽培苹果ERF114通过调节100 MdPRX63的表达和增强木质素的生物合成，积极调节对腐皮镰孢菌的抗性；在拟南芥中，AtMPK3/AtMPK6磷酸化的ERF72促进了植保素的积累，从而增强了对灰葡萄孢菌的抗性。
百合在全球都属于高价值切花品种，但许多百合花容易感染镰刀菌枯萎病(Fusarium wilt，主要由尖孢镰孢菌引起)。尖孢镰孢菌感染会导致根部和鳞片腐烂、维管束阻塞、养分运输受阻，最终导致萎蔫和死亡。幸运的是，包括岷江百合在内的一些野生百合表现出对镰刀菌枯萎病的抗性。先前的研究表明，百合中的WRKY TFs可调节抗性基因的表达，如PR10、几丁质酶和防御素，从而积极调节对尖孢镰孢菌的抗性，但这一抗性机理仍有待探究。
技术方案
转录组学➕代谢组学➕蛋白质组学分析
比色法和比色法➕高效液相色谱分析
转录调控网络分析➕瞬时表达实验
研究意义
研究人员利用转录组、代谢组和蛋白质组等多组学技术探索与抗镰刀菌枯萎病相关的代谢物，并分析TFs以及这些代谢物的抗菌作用，发现苯丙烷代谢在岷江百合中对镰刀菌枯萎病的防御反应中起着至关重要的作用，而LrERF4是苯丙烷生物合成的正调控因子。研究结果为百合属物种的基因组研究工作奠定了坚实理论基础。
▲接种尖孢镰刀菌后岷江百合根部的转录组学分析
岷江百合转录组数据中有10,181个与代谢相关的单基因，其中大量unigenes参与了次生代谢物的生物合成，因此大量代谢相关的unigenes被进一步鉴定。
▲接种尖孢镰刀菌后岷江百合根部的蛋白质组学分析
▲接种尖孢镰刀菌后岷江百合根部的蛋代谢组学分析
病原体激活的植物防御机制。对转录组、蛋白质组和代谢组数据的综合分析表明，在受尖孢镰刀菌感染的岷江百合中，苯丙烷类生物合成途径被高度上调。参与苯丙烷类、黄酮类和异喹啉生物碱生物合成的通路在早期尖孢镰刀菌感染期间(2 dpi)快速差异表达；在岷江百合和尖孢镰刀菌相互作用期间(4 dpi)，黄酮和黄酮醇生物合成途径的表达也有差异，苯丙氨酯、黄酮和异喹啉生物碱生物合成途径的表达也有差异；在尖孢镰刀菌感染后期(6 dpi)，根据多组学数据，苯丙烷和类黄酮的生物合成途径仍有差异表达。
这些途径，以及谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化、植物激素信号转导和MAPK信号转导，都在尖孢镰刀菌感染后发生了显著变化。这些结果表明，苯丙烷代谢、激素信号和MAPK信号参与了岷江百合对镰刀菌枯萎病的抗性。
▲岷江百合在尖孢镰刀菌感染期间苯丙烷生物合成的多组学综合分析
除苯丙烷外，其他如单萜类和异喹啉生物碱等次生代谢产物在植物的防御反应中也起着重要作用。红皮云杉Ophiostoma bicolor侵染期间，单萜类化合物的生物合成增加。一种被称为柠檬醛的单萜类物质增强了本氏烟草对烟草花叶病毒的抗性。代谢组学分析表明，在感染白粉病菌期间，L-DOPA左旋多巴等代谢物在抗性大肠杆菌中比易感大肠杆菌积累更多。研究发现，从腺毛唐松草(Thalictrum foetidum)中分离出的Thalicfoetine能抑制枯草芽孢杆菌的生长。本研究的多组学分析表明，除了产生苯丙烷外，单萜类化合物(双(牻牛儿基)二磷酸盐)和异喹啉生物碱(多巴胺)的生物合成可能在岷江百合和尖孢镰刀菌相互作用中起重要作用。这些结果表明，次生代谢对岷江百合抵抗镰刀菌枯萎病的调控是复杂的，因此这些调控网络对尖孢镰刀菌防御反应的贡献还需要进一步研究。
▲在尖孢镰刀菌感染期间，岷江百合鳞片中木质素、总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素的积累速度很快，且高于“Siberia”中的积累速度
▲总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素对尖孢霉生长有抑制作用
植物中的病原真菌感染会导致抗性相关代谢物(如苯丙烷)的积累。从苯丙氨酸中提取的苯丙烷主要分为木质素和木质素的前体、类黄酮和羟基肉桂酸，它们对植物的生长发育和抗病性起着至关重要的作用。代谢组分析表明，在不同的时间点，岷江百合中抗尖孢镰刀菌的的苯丙烷含量有所增加。进一步的分析证实，以“Siberia”为对照，在岷江百合感染尖孢镰刀菌期间，木质素、黄酮类化合物、阿魏酸、根皮苷和槲皮素等苯丙类化合物积累。在尖孢镰刀菌感染期间，“Siberia”中这些苯丙烷含量的变化比岷江百合小得多。总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素对尖孢镰刀菌的生长和致病相关基因的表达有抑制作用。由此看来，激活苯丙类代谢对于保护岷江百合免受镰刀菌枯萎病侵袭的QTR机制至关重要。
▲苯丙烷对尖孢镰刀菌的转录调控网络分析
植物对病原体的防御反应以苯丙烷代谢为基础，其特征已部分确定。在水稻中，MYB30能激活木质素生物合成基因，从而增加木质素的积累，增强对稻瘟病菌的抗性。施用某些苯丙氨酸(如山柰素和芹菜素)可增强小麦对尖孢镰刀菌的抗性。氯原酸是一种羟基肉桂酸衍生物，可通过诱导活性氧的爆发来限制藤仓镰刀菌的生长。黄酮类化合物可以破坏病原体的质膜、扰乱线粒体功能和抑制细胞壁的形成，所有这些都会对病原体的生长产生不利影响。
在这项研究中，从岷江百合中提取的总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素对尖孢镰刀菌的生长和致病相关基因的表达有抑制作用。这些结果表明，岷江百合中积累的苯丙氨酸有助于在尖孢镰刀菌感染期间形成物理和化学防御屏障。
▲LrERF4通过上调木质素、总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素的生物合成，增强了“Siberia”对尖孢镰刀菌的抗性
在病原体感染期间，转录因子在植物的转录重编程中起着至关重要的作用，影响着抗性相关代谢物的积累。MdMYB1r1能正向调节MdBGLU40的表达，促进香豆素的合成，从而抑制苹果壳囊孢的感染。在被尖孢镰刀菌感染的陆地棉中，VIIIc WRKY TFs激活GhMKK1的表达，通过涉及GhNTF6和GhMYC2的MAPK级联导致类黄酮的生物合成。菊花(Chrysanthemum morifolium)中WRKY6-1通过减少水杨酸的生物合成、诱导活性氧的产生和抑制CmWRKY15-like表达，负向调节菊花对尖孢镰刀菌的抗性。在葡萄中，MYB1能上调VdSTS2的表达，从而增加白藜芦醇的含量并增强对白粉菌的抗性。
研究人员对转录调控网络的分析表明，ERF、bZIP 和WRKY TFs可能调控苯丙烷化合物的生物合成。通过反向遗传学研究发现，LrERF4在尖孢镰刀菌感染期间调控苯丙烷类化合物的积累。通过增加木质素、总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素的含量，瞬时过表达LrERF4可保护“Siberia”免受尖孢镰刀菌的侵染。相反，RNAi介导的LrERF4在岷江百合中的表达抑制阻止了这些苯丙烷类化合物的积累，并降低了对尖孢镰刀菌的抗性。因此，LrERF4通过调节防御相关苯丙烷的生物合成，正向调节岷江百合对枯萎病的抗性。
▲通过LrERF4 RNAi处理，岷江百合抗性下调，木质素、总黄酮、阿魏酸、根皮苷和槲皮素含量降低
