经典案例 | 中华猕猴桃泛基因组揭示果实脱绿结构变异机制
近期，安徽农业大学在Advanced Science上发表了研究成果，构建了高质量中华猕猴桃泛基因组，揭示了遗传变异机制，并鉴定了一个介导果实着色和果实品质的新型SV。
文章题目
Graph-Based Pangenome of Actinidia chinensis Reveals Structural Variations Mediating Fruit Degreening
第一作者：Yingzhen Wang
通讯作者：Yongsheng Liu, Songhu Wang, Junyang Yue
通讯单位：安徽农业大学
杂志：Advanced Science
影响因子：15.1/Q1
文章链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202400322
研究背景
果实成熟是果实发育的最后阶段，与果实色泽、口感、香气和硬度的多重变化有关。大多数物种的果实在成熟过程中都会出现脱绿现象(叶绿素流失)，但膳食水果中合成的叶绿素在成熟过程中会发生降解。猕猴桃是成熟后仍能保持绿色果肉(叶绿素含量高)的特殊水果之一，然而这一机制在很大程度上仍不为人所知。
猕猴桃属于多年生木本植物，维生素C含量特别高。虽然猕猴桃属有54个品种，但只有4个品种(A. chinensis、A. deliciosa、A. eriantha和A. arguta)已被培育成商业栽培品种。一般来说，叶绿素(绿)、类胡萝卜素(黄)和类黄酮(红)这三种主要色素是猕猴桃新鲜果实着色的原因。尽管之前的研究发现了许多参与调控这些色素积累的基因，但猕猴桃果实着色的基因变异(如结构变异)仍有待探究。基因组质量低、数量少，阻碍了对不同猕猴桃品种(尤其是 SVs)间遗传变异特征的完整描述，因此有必要从更多猕猴桃品种中开发更多高质量的基因组组装。
技术方案
基因组➕单倍型解析基因组组装
泛基因组构建
结构变异分析
研究意义
研究生成了基于图的中华猕猴桃泛基因组数据集，首次发现了介导果实脱绿过程的SV，并揭示了猕猴桃绿瓤果实形成的未知机制，为进一步研究基因组进化和驯化、QTL基因功能以及基因组辅助育种提供了宝贵遗传信息。
▲从19种驯化猕猴桃中选出的7个具有代表性的品种
6个猕猴桃品种的
染色体和单倍型基因组组装
根据系统发育关系，研究人员从19个中华猕猴桃驯化品系中选出了7个具有代表性的品种，其中大部分是商业栽培品种，分为三个不同的组别：红瓤果(RF)组，包括“Hongyang”和“Zps18”两个品系；黄瓤果(YF)组，包括“Hort16A”、“Huangyang”和“Jinmi”三个品系；绿瓤果(GF)组，包括“Biyu”和 “Jinpai”两个品系，代谢物的生物合成和积累在很大程度上取决于这些品种的遗传多样性。
除“Hongyang”单倍型解析基因组组装外，还对其他六个品种进行了PacBio HiFi测序，共生成174~777个contigs，N50值为15.6~20.4 Mb，与之前已有的三个猕猴桃基因组相比，N50值明显较高，而contigs的数量相对较少。染色体平均长度与contig N50 值之间的大小几乎相同，这表明单体型解析的装配质量较高。
最终获得了14个高质量的染色体级基因组组装，总大小为592.7~606.1 Mb；BUSCO评估值在98%以上，LAI值均在15以上，表明这些组装体具有很高的完整性和连续性；共鉴定出41.3%~42.5%的重复序列，其中LTR-RT最丰富，占21.8%-23.6%；还鉴定了326,728~332,523个SSRs，并将其分为七种类型；在这些组装中，共鉴定出了44,336~46,634个基因，基因长度为 5234~5522 bp，CDS长度为1161~1199 bp；基因BUSCO得分为95.7%~97.2%，表明基因结构注释结果质量较高，适合进行下游分析。
▲猕猴桃泛基因组的组成
基于蛋白编码基因的猕猴桃泛基因组
利用OrthoFinder将639,349个基因聚类为49,770个非冗余泛基因簇，根据分布情况发现，共有23,217个核心基因(46.6%)，26,553个非必需基因(53.4%)，6278个(12.6%)次核心基因、26个cloud基因(0.1%)和20,249 个(40.7%)shell基因。平均而言，每个猕猴桃基因组的核心基因占64.3%，次核基因占14.7%，shell基因占19.5%，cloud基因占1.4%。
核心基因的长度和表达水平明显高于非必需基因，后者的Ka/Ks值高于核心基因，表明其可能受到强大的选择压力。GO富集结果表明，核心基因主要参与细胞分化调控、转录调控区、转录因子活性和序列特异性DNA 结合等基本生物学过程；非必需基因涉及初级和次级代谢过程，如蔗糖代谢等。KEGG分析表明，核心基因主要富集在其他糖降解、氨基糖和核苷酸糖代谢以及玉米素生物合成等途径中；而非必需基因则显著富集在类固醇激素生物合成、氮代谢和异黄酮生物合成等途径中。
▲猕猴桃共线性比对、遗传变异和基于图的泛基因组
猕猴桃基因组结构变异特征
通过对基因组间共线区块进行全局比对，对7个猕猴桃品种的遗传变异进行了全面检测，包括SVs、InDels以及SNPs。共鉴定出13,914~20,883个SVs，其大小占每个基因组的1.98%~4.28%；在这四种SVs中，存在和缺失的数量几乎相等，且明显多于倒位或易位的数量；7个猕猴桃品种中“Zps18”或“Huangyang”的SVs数量明显低于其他品种，而绿果组的SVs数量最多，这表明它们与 “Hongyang”的关系不同。研究人员分析了SVs在7个猕猴桃品种中的分布频率，发现大多数SVs都集中在单个品系中，这表明不同品种中存在许多独特的SVs。
此外，还研究了SVs的基因组位置，发现大多数SVs位于非编码区，尤其是基因间区(>60%)和内含子区(>34%)，只有一小部分位于外显子区(<4%)。通过整合RF栽培品种“Hongyang”和GF栽培品种 “Biyu”的转录组数据，研究人员发现在启动子中含有SV的基因中，约11%~19%的基因在两个栽培品种之间的基因表达水平有显著变化。
▲七个猕猴桃基因组的遗传变异
利用Svimmer合并了来自7个猕猴桃品种的SVs，共获得了84,591个非冗余SVs，结果表明，SVs在29条染色体上分布不均，其中Chr16上的SV密度最低；在每条染色体上，SV的分布也不均匀，存在一些热点区域。研究人员对全基因组进行了SV统计，发现了161个SV 热点，表明这些区域出现了多个独立的SVs。在Chr27上发现了一个包含12个LRR-RK基因的热点区域，这些基因在信号识别和对环境刺激的反应中起着关键作用。这些发现与SV热点区域可能会经历更强的环境选择的观点一致。
研究人员将所有检测到的结构变异整合到“Hongyang”的hap1基因组中，构建了基于图的猕猴桃泛基因组。
与果实颜色有关的结构变异
无论是 RF、YF还是GF栽培品种，果实在发育初期都是绿色的，这是叶绿素积累的结果；类胡萝卜素产生的黄色取决于成熟过程中的脱绿(叶绿素降解)。一些研究表明，RF和YF中叶绿素的降解部分是由SGR2的高表达引起的，它编码猕猴桃成熟阶段叶绿素降解的关键酶和限速酶，这表明叶绿素降解可能在猕猴桃果实着色过程中起着关键作用。
在这项研究中，研究人员分别鉴定了与花青素积累和叶绿素降解途径相关的149个和108个SVs，在花青素途径中发现的149个SVs中，有14个是红瓤组所特有的。这些独特变异涉及FLS、F3H和F3'H等基因，其中一个位于上游，两个位于下游，16个位于各个功能基因的基因间区。根据转录组分析，这些基因在果实中的表达水平大多很低。只有一个基因F3H(Achv4p01g000245)在GF“Biyu”中大量表达，但在RF“Hongyang”中却出现下调，这表明F3H并不是影响RF栽培品种果实花青素积累的关键基因。并且，在已被证实能调控猕猴桃花青素积累的AcMYB110、MYB27和AcMYB123等特征基因中没有发现RF特异性SV。
▲鉴定与叶绿素降解有关的SVs
在叶绿素降解途径中发现的108个SVs中，有20个是绿瓤栽培品种的特异性SVs。一些绿瓤特异性SV与叶绿素分解代谢的关键基因有关，如SGR、SGRL和NYC1。然而，大多数SVs位于基因间区和内含子区域，这些基因在RF“Hongyang”和GF“Biyu”之间并没有表现出明显的表达差异。仅在GF组“Biyu”(hap2)和“金牌”(hap1)中检测到一个位于BCM(叶绿素代谢平衡)同源基因(AcBCM)启动子上的SV，且AcBCM的表达水平在“Hongyang”和 “Biyu”之间存在显著差异。此外，还将RF组和YF组中其他12个品种的重测序数据与猕猴桃泛基因组进行比对以检测结构变异，结果发现，这12个品种中都不存在SV。
序列分析表明，该SV是Helitron型转座元件(TE)， PCR分析表明，RF和YF栽培品种分别检测到一个band，而GF则检测到两个bands，对这两个bands的Sanger测序证实了SV的存在。因此，研究人员推测“碧玉”和“金派”中SV诱导的BCM高表达可能通过抑制猕猴桃中的SGR来导致叶绿素积累(绿瓤)。猕猴桃的绿瓤栽培品种非常有限，研究人员还发现了另外两个四倍体的绿肉品种(“Cuiyu”和 “Wuzhi No.3”)，并通过PCR检测了SV，发现这两个四倍体绿瓤栽培品种都含有BCM基因启动子的变异。这些结果进一步证实了该变异与猕猴桃绿瓤品种表型的相关性。
▲SV诱导的AcBCM高表达可通过破坏AcSGR稳定性来增强叶绿素积累
GF栽培品种中AcBCM启动子的SV
可增加AcBCM的表达和叶绿素的积累
利用RF栽培品种“Hongyang”(HY)和GF栽培品种 “Biyu”(BY)来研究SV的作用，发现类胡萝卜素含量在二者之间无显著差异，授粉后90天和120天(-DAP)果实的叶绿素含量在HY和BY之间也没有差异；然而，在150天DAP期，BY的叶绿素含量远高于HY，这可视为BY成熟期的“常绿”表型。qRT-PCR结果表明，HY 150 DAP果实中AcBCM的表达水平明显低于BY。
通过在烟草叶片中瞬时表达AcSGR2、AcBCM以及这两个基因的组合，发现过表达AcBCM可以抑制AcSGR2诱导的叶绿素降解。免疫印迹分析也证实，过表达AcBCM可降低AcSGR2的蛋白丰度，表明AcBCM在拟南芥中具有与BCM相同的功能。此外，研究人员还制作了分别识别内源AcSGR2蛋白和AcBCM蛋白的抗体。免疫印迹证实，在150 DAP时，BY中的BCM蛋白水平远高于HY，这与qRT-PCR结果一致。BY中的SGR蛋白水平明显低于HY，这可能是BCM诱导的SGR2降解所致，因为BY中SGR2的mRNA水平仅略低于HY。此外，BY 120 DAP的SGR2 mRNA水平远低于150 DAP，但其蛋白水平却略高于150 DAP，这可能是由于150 DAP中AcBCM的丰度较高所致。这些结果表明，AcBCM诱导的AcSGR2蛋白降解在BY发育后期发生并导致叶绿素积累。
为了确定SV是否影响AcBCM基因在发育后期的表达，使用HY的AcBCM启动子(Pro-HY)和不含51 bp片段的BY hap2 启动子(Pro-BYhap2)来驱动GUS表达。将含有这两种载体的农杆菌注入145 DAP的HY果实中，GUS染色表明Pro-BYhap2的转录活性明显高于Pro-HY，GUS基因的qRT-PCR分析也证实了GUS染色的结果。此外，研究人员在Pro-BYhap2上添加了SV(51 bp)，构建了与Pro-BYhap1相似的突变启动子Pro-BYhap2+SV。GUS染色和qRT-PCR表明，Pro-BYhap2+SV的转录活性与Pro-HY相似，但远低于Pro-BYhap2。这些结果表明，BCM启动子中的SV(缺失51 bp)导致其在BY果实发育后期有较高的表达量。
此外，还构建了抑制BCM表达的RNAi载体，用含有AcBCM-RNAi载体或空载体(作为对照)的农杆菌浸润GF栽培品种140 DAP果实，发现与空载体相比，注入AcBCM-RNAi载体的果实绿色较少。qRT-PCR和叶绿素含量测定表明，与空载体相比，AcBCM-RNAi的果实中AcBCM mRNA水平和叶绿素含量显著降低。这些结果表明，SV诱导的AcBCM高表达有助于BY的叶绿素积累。
