经典案例 | 近乎完整黄瓜参考基因组和多组学数据库Cucumber-DB发布！

▲(A)：CLv4.0和CLv3.0基因组序列的共线性和基因组特征比较分析

利用PacBio HiFi、ONT和Hi-C综合技术对黄瓜材料进行了测序， 在使用HiFi数据进一步纠错后，最终的基因组组装(命名为Chinese Long v4.0 ，CLv4.0)大小为321.53 Mb ，只有第2条染色体上有一个缺口。

CLv4.0汇编成功填补了CLv3.0里72个缺口中的71个，增加了95.32 Mb的序列。这些新序列的大部分(87.28%)位于异染色质区域，包括卫星序列(I/II/III/IV型)、45S rDNA序列和转座元件(TE)，这使得III型卫星序列和45S rDNA的很大一部分(73.78%，8.29 Mb)得以完整组装，唯一剩下的缺口位于Chr.2。

研究人员在着丝粒周围区域检测到了8个和22个大型I/II型和IV型卫星阵列(>100 kb)，在着丝粒区域或其附近检测到了28个大型III型卫星阵列。所有七个着丝粒都已完全解析，其位置是根据已发表的使用CsCENH3抗体进行染色质免疫沉淀测序的CsCENH3富集水平确定的。七个着丝粒的平均长度为0.87 Mb，其中最长的在第4号染色体上(1.08 Mb)，最短的在第2号染色体上，这表明着丝粒的长度与染色体的大小无关。着丝粒的主要成分是177-bp的III型卫星DNA，平均占78.24%，其次是Copia型(14.50%)和Gypsy型LTR。此外，所有13个富含卫星的亚端粒区都扩增了11.11 Mb，在Chr.6末端解析出了一个完整的端粒。

▲(B)：CLv4.0和CLv3.0基因组组装的5个主要重复序列的长度

(C)：黄瓜CLv4.0和CLv3.0基因组中Copia和Gypsy LTRs的拷贝数

(D)：饼状图显示了EVM、Illumina和Iso-Seq转录本在CsRTD1中的比例

(E)：与CLv3.0注释相比，CsRTD1中的5'UTR、3'UTR、CDS和外显子的长度有显著改善

(F)：与CsRTD1(橙色)相比，CLv3.0注释中mis-split和mis-merged基因的示例(紫色)

与CLv3.0相比，CLv4.0组装还发现TE长度增加了两倍多(140.72 Mb对比62.55 Mb)。Copia型LTRCLv3.0中的丰度低于Gypsy型LTR，但在CLv.4.0中显示出较高的丰度，表明其在之前的组装中代表性不足。之前的一项研究表明，黄瓜中的LTRs在大约100万年前出现了一次新的爆发，但这并不影响甜瓜或西瓜。研究所得的近乎完整基因组显示，与Gypsy型LTR 不同，Copia型LTR是这一近期爆发的主要贡献者。这些发现表明CLv4.0作为参考基因组的质量较高。

研究人员采用多种方法评估CLv4.0集合的准确性和完整性，原始数据包括HiFi、ONT和NGS读数)被重新映射到CLv4.0集合，实现了超过99.7%的高映射率。测序读数在整个基因组中显示出均匀的覆盖率，除了单个间隙和不完整的亚基因组区域，来自未组装重复序列的读数也被比对。Merqury k-mer分析得出的质量值达到56，表明CLv4.0组装的准确性很高。此外，BUSCO评估组装完整性为98.8%，LTR组装指数(LAI)为11.1。CLv3.0和CLv4.0基因组之间的共线性分析发现了Chr.3上的两个大的倒位(>100 kb)。通过比较使用Chinese Long的Hi-C数据构建的CLv3.0和CLv4.0基因组的Hi-C接触矩阵，进一步验证了CLv4.0中这些区域的准确组装。

CLv3.0注释缺乏选择性剪接和转录本信息，而这些信息对于accurate transcript quantification(转录本定量)和differential transcript usage (DTU)分析至关重要。为了实现全面准确的基因组注释，研究人员制备了168个样本，代表了处于不同发育阶段的29种不同组织，以及经过七种非生物和生物胁迫处理的叶片，还对所有168个样本进行了ssRNA-Seq处理。通过整合和人工校正构建了第一个版本的黄瓜参考转录本数据集(CsRTD1)，其中包括27,360个蛋白编码基因和177,571个转录本，平均每个基因有6.6个转录本。值得注意的是，绝大多数(87.92%)的转录本都表现出了由Iso-Seq长读数数据推导出的结构，剪接接头和转录起始与终止位点都得到了准确定义。CsRTD1的BUSCO得分为99.19%，只有0.62%的基因缺失，表明基因组注释接近完整。

在CsRTD1注释中共发现了5070个新的蛋白编码基因，与CLv3.0注释相比，有1875个基因位于以前未知的区域。表达图谱中有60.69%的基因(1138 个)在一个以上的组织中表达。对这些基因进行的GO分析显示了与苹果酸酶活性、氧化还原酶活性、初级代谢过程和有丝分裂细胞周期相关的重要terms。还发现了四个新的Cs-ACS7基因，它们编码乙烯生物合成途径中的限速酶，其中三个Cs-ACS7基因在热休克后3或6小时内上调，表明它们在热耐受性方面的潜在作用。

▲(G)：黄瓜数据库的数据资源、工具包概述以及功能示例

尽管发布了黄瓜基因组变异图谱和泛基因组，但由于没有专门的黄瓜数据库，这些宝贵资源的充分利用一直受到限制。为了解决这个问题，研究人员开发了黄瓜数据库(http://www.cucumberdb.com/)，这是一个整合了大量基因组学和转录组学数据的多组学数据库。

这个综合数据库包括三个主要数据集和工具：（1）黄瓜基因组组装和注释：除CLv4.0组装外，Cucumber-DB还提供11个更具代表性的黄瓜基因组组装，包括三个野生种和八个栽培品种；

(2）黄瓜变异组：以CLv4.0基因组为参考，从115个核心种质登录的公共重测序数据中鉴定出863万个SNP和180万 InDels；此外，通过将11个代表性基因组与CLv4.0基因组进行比对，检测到了13,551个SVs；还精确定位了黄瓜驯化和分化过程中受到选择的重要基因组区域，以便进行系统发育分析；

(3）黄瓜转录组：利用CsRTD1和大量ssRNA-seq数据创建了全面的基因表达图谱；还加入了用户友好型eFP查看器，以显示空间和胁迫响应基因表达模式，这有助于缩小定位克隆候选基因的范围。

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选择性剪接(AS)调节着各种生物过程中的基因表达和功能，图谱提供了转录本序列和表达谱以及AS信息，为研究AS对特定基因的影响提供了新的见解。例如，在Iso-Seq长读数的支持下，辅助素反应蛋白基因CsARP1(CsaV4_7G000369)检测到了三个不同的转录本，其中包含两个AS事件。CsARP1是CsCRC的直接下游靶标，这三个转录本在整个图谱中显示出不同的表达水平和模式，可能是由于AS事件所致。

还构建了共表达网络以协助进行详细的功能分析，如探索TF的下游靶标。此外，研究人员还创建了一套用户友好型工具包，包括用于序列检索的GetSequence模块、用于序列比对的BLAST模块、ID转换模块、用于PCR的引物设计模块、用于功能分析的GO/KEGG富集模块以及用于基因编辑的CRISPR设计模块。