经典案例 | 西瓜T2T超级泛基因组发布！

为了创建一个代表整个瓜属遗传多样性和基因组结构的超级泛基因组，研究人员根据系统发育关系和429个accessions的地理分布选择了27个具有代表性的accessions，各品种表型差异很大。

利用Illumina、HiFi、ONT和Hi-C综合技术组装了27个具有代表性的西瓜T2T基因组，组装后的基因组平均包含两个间隙，表明组装的高准确性和连续性。按照G42基因组组装的描述，使用HiFi和ONT超长读数测序数据填补了空白，并对每个填补空白区域的质量进行了评估，最终组装的基因组大小介于361.3 Mb和413.6 Mb之间，平均为375.2 Mb。此外，还组装了27个西瓜品种的叶绿体和线粒体基因组，平均长度分别为156.9 kb和622.2 kb。

从多个角度对组装质量进行了评估，重复DNA约占每个基因组的56.2%，其中Gypsy元件最为常见。在基因注释方面，对不同发育阶段的多个组织进行了RNA-seq，预测每个基因组平均有24,698个蛋白编码基因。

▲ 用于T2T或无间隙组装的西瓜品种的遗传多样性和表型

为了探索基因家族的基因组图谱，根据28个accessions的PAV构建的系统发育树与之前利用SNPs对瓜属的分类接近。通过观察每次添加新基因组时泛基因组、核心基因组和可变基因组基因数量的变化，估计了新加入基因组的代表性。28个accessions的大小约为每个单个基因组的1.5倍，相对于栽培西瓜增加了11,225个基因家族。与参考文献中讨论的研究相比，本研究的泛基因组发现了8,736个新的基因家族，其中4,913个基因家族由 C. rehmii、C. ecirrhosus和C. naudinianus这几个物种所贡献。

总体而言，每个基因组中平均分别有42.78%、8.80%、45.87%和2.55%的基因被归类为核心基因、次核心基因、可变基因和私有基因。在每个物种中，平均分别有52.72%、43.81%和3.47%的基因被鉴定为核心基因、可变基因和私有基因。可变基因和私有基因是物种间表型多样化的主要原因。核心基因和可变基因在基因组和物种之间的有无分布导致基因PAV差异高达约40%，表明西瓜基因组具有高度可塑性。

共有96.3%的核心基因和88.0%的次核基因含有注释的InterPro域，大大高于可变基因和私有基因（分别为55.6%和32.4%）。核心基因的平均表达水平大大高于可变基因和私有基因；核心基因的核苷酸多样性（π）低于可变基因。这些结果共同支持了一个前提，即核心基因参与基本的生物过程，可变基因表现出更大的遗传变异，可能在环境适应方面发挥作用，而私有基因可能在决定物种个体形态特征方面发挥重要作用。

▲28个西瓜品种的泛基因组和核心基因组分析

与SNPs相比，SV对基因组多态性和功能基因变异的影响更大。通过将27个新基因组与G42参考基因组进行比对，所有461,987个非冗余SV包括 217,076个缺失（46.99%）、239,698个插入（51.88%）、3,122个重复（0.67%）、1,278个倒位（0.28%）和813个易位（0.18%）。将这些数据与G42进行比较，发现每个序列平均有 81,132个SV，这些SV平均影响了每个序列150 Mb的基因组序列。通过绘制所有组装变异及其与参考基因组的共线性，研究人员建立了一个全面的SV图谱，该图谱显示栽培西瓜的遗传多样性较窄，但野生西瓜的遗传变异明显更大。

据报道，大倒位可以通过减少交叉重叠来抑制重组。在PKR6（C. lanatus）序列的Chr11上，保留了两个从C. amarus继承而来的大倒位（4.8 Mb和2.5 Mb）。在构建的遗传图谱中曾有大型倒位的报道，并被证明可大大降低重组频率。通过回交育种从C. amarus中引入位于这些区域附近的基因可能会导致意外表型的严重连锁阻滞。对这些大型（大于100 kb）倒位/易位区内外的基因进行了鉴定和注释，发现这些基因主要与纤维素合成有关，这一点通过GO:0016759和GO:0030244等通路的大量富集得到了证明。此外，包括ClG42_04g0123000和ClG42_03g0079100在内的五个关键基因已被报道与种子大小和果实甜度等性状有关，这为了解这些SV的功能提供了宝贵见解。

西瓜中的SVs往往富集在重复DNA区域以及缺失和插入类型中，这与之前对大豆的研究结果一致。观察到平均有27.5%的SV与基因上游或下游的2 kbp区域重叠。平均有7.5%的SVs引起了氨基酸编码的变化，从而可能导致基因功能的多样性。研究人员将SVs扩展到了种群规模，并开发了基于图的泛基因组网络数据库（www.watermelondb.cn）。这些发现表明，超级泛基因组中的SVs反映了栽培西瓜及其相关物种进化过程中的巨大结构变化，加深了对瓜类进化过程中基因组和表型变化的理解。

▲28个西瓜基因组中基因SV的分布情况

染色体重排是相关物种间基因流动的障碍，因此在了解适应和物种分化方面具有重要意义。研究人员发现并验证了瓜属植物物种间的三个主要染色体重排，与其他三个瓜属植物（C. lanatus、C. mucospermus和C. amarus）相比，在C. colocynthis中发现了涉及chr01和chr04的大量染色体间重排。染色体结构的这些变化可能会导致生殖隔离，影响杂交育种能力，减少种间重组，最终导致瓜属种的分化。为了研究不同西瓜品种间三维基因组的保存和变异情况，使用50 kb分辨率矩阵鉴定了A/B区，结果表明，A区和B区在西瓜物种间相对保守。据报道，A区和B区的变异与基因组SVs密切相关，在不同类型的SVs中，研究人员观察到一个4.5 Mb的反转导致A和B区隔的变化。

以前的报告表明，西瓜的祖先可能是C. lanatus subsp. cordophanus，研究人员发现野生西瓜（C. amarus）和栽培西瓜（C. lanatus）之间的SVs有爆炸性增长。相比之下，C. mucospermus 和栽培西瓜的SVs没有明显差异。发现了362个出现在C. lanatus中的 SVs，其中33个遗传自C. mucospermus，68个遗传自C. lanatus subsp. cordophanus，200个遗传自C. mucospermus和C. lanatus subsp. cordophanus。G42、C. mucospermus和C. lanatus subsp. cordophanus的三个基因SVs中ClG42_07g0080600是通过选择性扫描鉴定的，而 ClG42_01g0030700和ClG42_03g0058200据报道分别与果实大小和种皮颜色的数量性状位点（QTLs）有关。

C. lanatus和C. mucospermus携带相同的单倍型，而C. lanatus subsp. cordophanus基因组图谱显示了栽培西瓜基因组及其两个可能祖先的大反转。在C. lanatus中检测到的反转是从C. lanatus subsp. cordophanus和C. mucospermus遗传而来的。在C. lanatus中发现的一些SVs不仅遗传自C. lanatus subsp. cordophanus，也遗传自C. mucospermus，这表明在栽培西瓜的品系中存在cordophanus以外的祖先。

▲西瓜物种之间的分化和驯化西瓜的起源

在西瓜的驯化过程中，基因的增殖和丢失有助于抗病、糖分积累和果肉着色相关基因的多样化。利用不同西瓜和相关葫芦科物种的单拷贝同源基因进行的比较分析揭示了它们的分化时间，C. naudinianus的分化时间大约在16.75Mya，最近的分化事件发生在C. lanatus和C. mucospermus之间，大约在0.76Mya。值得注意的是，在西瓜进化和驯化过程中，丢失的基因多于获得的基因，阐明了整个驯化过程中的若干基因变化。

PKR6是通过种间杂交获得的具有多种抗病性的近交系，在1号染色体的5厘米区域发现了一个QTL，命名为Qfon1.1，赋予其对Fon race 1的抗性。通过将QTL区域的PKR6基因组序列与易感品系G42的基因组进行比对，将QTL缩小到了一个很小的区域（364 kb）。PKR6对Fon race 2的高水平抗性使其成为比CWR更好的选择，可用于向优良西瓜导入抗性。在Chr11上检测到了来自PI 296341-FR（C. amarus）的Large linkage drags（2-5 Mb）。PKR6的开发表明，利用现有的基因组信息，可以有目的地将丢失的抗性基因整合到优良品系中。未来的工作重点可能是将C. naudinianus、C. ecirrhosus和C. rehmii的抗性基因导入西瓜优良品系。

在栽培西瓜中，甜度和果肉颜色的提高幅度最大。拷贝数变异（CNV）分析表明，TST2基因（ClG42_02g0107100、ClG42_02g0107200）的扩增有助于糖分积累，LCYB基因（ClG42_04g0042900）的碱基变化导致西瓜果肉着色。分析还表明，TST2与LCYB-GG的重复拷贝和TST2与LCYB-TA的单拷贝之间存在很强的相关性，表明在西瓜驯化过程中，TST2和LCYB同时被驯化。此外，研究发现染色质磷酸盐转运体ClPHT4;2（ClG42_10g0214700）的高水平表达是果肉着色的必要条件，与野生西瓜相比，栽培西瓜的糖和植物激素信号介导ClPHT4;2转录的模式不同。这表明，TST2基因的拷贝数可能是调节糖分信号通路的阈值开关，从而调节ClPHT4;2的表达，导致西瓜糖分积累和果实着色的共同选择。重新引入丢失的抗性基因以及了解糖分积累和果肉着色的共同进化对有效的西瓜育种计划至关重要。

▲在西瓜进化过程中的基因扩增和收缩

据报道，选择影响了西瓜果实的多种农艺性状，包括苦味、含糖量、果肉颜色、形状、成熟度和种子大小。为了研究已发现的与这些性状相关的基因是否受到环境或人类选择的影响，研究人员扫描了位于C. colocynthis、C. amarus、C. mucospermus和C. lanatus的启动子和CDS中的SVs。还通过比较野生西瓜和栽培西瓜对选择性扫描进行了分析，以探索可能有助于性状多样性的携带SV的新候选基因。研究发现，功能基因的SVs存在于C. colocynthis和C. amarus中，但在C. mucospermus和C. lanatus中却不存在，这表明这些SVs很可能在物种演化和驯化过程中被选择性地排除了。功能基因中的SV通常位于起始密码子的上游，少数位于编码区。基因表达可能受到SV的影响，进而导致一种或多种农艺性状发生变化。此外，与果实甜度、苦味和果肉颜色有关的基因的 SV 与不同品种果实中的表达模式一致。

西瓜果实的一个关键驯化特性是失去苦味 ，如前所述，从西瓜中分离出的主要苦味化合物是CuE，据报道野生物种的根和果实中都有CuE，但栽培物种的根中只有CuE。在西瓜物种中，CuE的合成通过组织特异性调节因子进行不同程度的控制。尽管有报道称ClBt（ClG42_01g0033300）是一种果实特异性葫芦素调节因子，可启动西瓜果实中CuE生物合成途径的第一步，但它在叶片中的表达似乎高于果实，在大多数品种的果实样本中几乎为零表达。此外，在C. colocynthis和C. amarus中分别发现了位于ClBt起始密码子上游941 bp和247 bp的6-bp和18-bp缺失。Cl890B（ClG42_01g0153000）、Cl170（ClG42_06g0015500）、Cl180（ClG42_06g0015600）和ClACT（ClG42_06g0015800）也参与了 CuE 的生物合成途径，ClMATE1（ClG42_01g0153300）与西瓜中CuE的转运有关。在C. colocynthis的启动子或CDS区域检测到SVs，在C. amarus中也检测到少量SVs。这五个bitterness基因的表达水平在C. colocynthis中最高，在C. amarus中急剧下降，在C. mucospermus和C. lanatus中几乎没有表达。表达水平与CuE含量呈正相关。

与葫芦素含量降低相反，糖和色素在栽培西瓜果肉中积累。在远缘种C. colocynthis和C. amarus、近缘种C. mucosospermus和驯化种C. lanatus中检测到了TST2的CNV和ClSWEET3（ClG42_01g0006000）、ClVST1（ClG42_02g0044600）、ClNAC68（ClG42_03g0079100） 以及 ClAGA2（ClG42_04g0035700）的SVs。在C. colocynthis和C. amarus中，ClPHT4;2的CDS区域分别有6-bp和12-bp的缺失。肉色与基因表达之间呈正相关，ClNCED1（ClG42_01g0254100）和ClNCED7（ClG42_07g0105300）也是如此。

与苦味、含糖量和果肉颜色在驯化过程中或减或增不同，果实形状、种子大小和果实成熟度的表型在不同物种之间存在差异。在驯化过程中，果实形状由小变大再变小，种子大小也有变化。虽然有报道称基因表达模式与果实形状和种子大小性状相关，但它们与SV的出现并不一致。在C. colocynthis和C. amarus中存在与果实成熟相关的两个基因的SV，但它们在四个物种中的表达不一致。驯化过程是复杂的。SV只是影响西瓜物种间差异的因素之一。

▲野生和栽培西瓜品种中与农艺性状有关的基因的SV分布和表达水平