新型“嫁接-移动”基因编辑系统实现植物可遗传非转基因的基因组编辑
1月3日，马克斯·普朗克分子植物生理学研究所Friedrich Kragler研究团队在Nature Biotechnology 上在线发表了最新研究成果。研究人员提出了一种新型“嫁接-移动”基因编辑系统，可为精准育种、重要农艺性状研究以及作物遗传改良提供有力支撑。
文章题目
Heritable transgene-free genome editing in plants by grafting of wild-type shoots to transgenic donor rootstocks
第一作者：Lei Yang, Frank Machin
通讯作者：Friedrich Kragler
通讯单位：马克斯·普朗克分子植物生理学研究所
杂志：Nature Biotechnology
影响因子：68.164/Q1
文章链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01585-8
研究背景
在植物中，为了获得无转基因突变体以及稳定基因组，Cas9酶和gRNA必须瞬时引入或从突变的后代中杂交。使用CRISPR/Cas9系统的植物基因组编辑技术在作物培养和改良中备受关注。但这种基于遗传转化的方法需要耗时长且造价昂贵，且大多数植物物种并不适合此种转化。
技术方案
结合CRISPR/Cas9基因组编辑系统
将可移动TLS元件融合至CRISPR/Cas9序列
生成“嫁接-移动”CRISPR/Cas9 RNA
跨物种下胚轴嫁接
研究意义
这种“嫁接-移动”基因编辑系统能够在一代中产生非转基因的后代，而不需要转基因消除、培养物恢复和选择，或使用病毒编辑载体。研究者认为，使用此种基因编辑系统进行非转基因植物生产要更为稳定高效，可被广泛应用于植物育种以及商业作物研发。
研究者假设，在Cas9和gRNA转录本上添加TLS元件将导致其根到茎的移动，并导致受体嫁接野生型组织的编辑。因此，将非转基因接穗嫁接到表达Cas9/gRNA的转基因可移动砧木上，所生成的种子则是进行过非转基因的基因编辑的。
▲可移动CRISPR/Cas9非转基因基因组编辑方法概览
经共折叠RNA结构预测证实，TLS motif的折叠不太可能在gRNA或Cas9融合结构中受到影响。此外，研究人员还发现将相关的TLS元件添加到gRNAs上并不会干扰gRNAs的功能。
在嫁接拟南芥中，Cas9/gRNA TLS融合体从根向茎移动
研究人员在表达Cas9-TLS1和gNIA1-TLS1或Cas9-TLS2和gNIA1-TLS2的砧木类似实验中发现，在嫁接的非转基因野生型芽中检测到了Cas9-TLS和gNIA1 TLS转录物，这一发现证实了添加TLS元件足以促进Cas9和gRNA转录物的远距离迁移。
▲Cas9和gNIA1-TLS融合从根到茎诱导幼年拟南芥NIA1编辑
可移动Cas9/gRNA产生可遗传基因编辑
通过基因组PCR和独立复制的桑格测序等一系列分析，发现受体野生型组织中存在预期的NIA1基因组缺失。这表明所递送的Cas9 TLS转录物在受体组织中被转化为功能蛋白，并且Cas9 TLS和gNIA1 TLS转录物都以足够量递送，以在成年植物的非转基因组织中有效编辑NIA1基因。
▲Cas9和gNIA1 TLS融合构建体在成年植物中具有功能性和可移动性
Cas9/gRNA-TLS从拟南芥根转移到油菜嫩枝
研究人员通过跨物种下胚轴嫁接方案将拟南芥作为砧木与野生白菜型油菜进行嫁接，而后发现这种新型基因编辑有效地促进了Cas9和gRNA转录物从拟南芥砧木到野生白菜型油菜接穗的远距离迁移。
▲Cas9-和gNIA1-TLS2融合体在白菜型油菜和拟南芥跨物种嫁接植株中具有移动性和功能性
此外，研究人员进一步推测，这种“嫁接-移动”Cas9 TLS和gRNA TLS融合的技术能够在玉米、小麦和水稻等主要粮食作物中得到应用。
