经典案例 | 首个水稻T2T完整参考基因组发布
近期，中国农业科学院深圳农业基因组研究所在Molecular Plant上发表了最新研究成果，报道了首个T2T水稻完整参考基因组T2T-NIP，并建立了在线数据库以提供AGIS-1.0基因组信息友好访问服务。
文章题目
A complete assembly of the rice Nipponbare reference genome
第一作者：Lianguang Shang, Wenchuang He, Tianyi Wang, Yingxue Yang, Qiang Xu, Xianjia Zhao
通讯作者：Lianguang Shang, Weihua Pan, Qian Qian
通讯单位：中国农业科学院深圳农业基因组研究所
杂志：Molecular Plant
影响因子：27.5/Q1
文章链接：
https://doi.org/10.1016/j.molp.2023.08.003
研究背景
2005年常用的水稻参考基因组(Nipponbare)最初是由国际水稻基因组测序计划发布的；此后在2013年进一步更新，改进了基因组组装(IRGSP-1.0)和基因注释(MSU7, RAP-DB) 。在过去的10年中，一些水稻基因组已经组装成只有2-5个端粒缺失的无间隙染色体，13年的数据仍然是最广泛使用的参考基因组。由于测序技术的限制，该文献中复杂区域的代表性不足，总共留下72个主要间隙(包括19个端粒)，167个次要间隙和779个未知碱基，估计基因组的长度为~3%
技术方案
Illumina、ONT、Pacbio HiFi 和Hi-C综合测序
群体变异分析
研究意义
研究弥合了缺失的3%基因组信息，报道了首个T2T水稻完整参考基因组，这是对水稻基因组重要资源的里程碑式更新，同时也为水稻改良育种、结构变异和功能研究提供了非常重要的理论价值。
▲Nipponbare完整基因组组装AGIS-1.0及其新增序列组成
为了获得水稻基因组无间隙完整序列，研究人员采用了Illumina、ONT、Pacbio HiFi 和Hi-C综合测序策略，将Pacbio HiFi和ONT超长reads整合在一起，生成原始contigs，然后在Hi-C数据集支持下，将其组装到染色体水平上进一步进行间隙填充和末端延伸，以弥合剩余的7个间隙和1个端粒区域。最终得到了一个完整Nipponbare水稻参考基因组T2TNIP(版本AGIS-1.0)，基因组大小为 385.7 Mb，其中所有12个着丝粒和24个端粒区域都被解析。
利用水稻CENH3抗体进行染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)，确定T2T-NIP中功能性着丝粒的位置和序列。T2T-NIP BUSCO评估达99.88%，等于或高于之前报道的无间隙水稻基因组。与之前的IRGSP-1.0版本相比，T2T-NIP包含12.5 Mbp的新鉴定序列。
▲以AGIS-1.0为参考基因组的重测序数据比对
研究人员为T2T-NIP制作了注释和组学数据集，包括基因模型、TEs、RNA测序和甲基化数据集，上传至在线数据库(http://www.ricesuperpir.com/web/nip)。
与IRGSP-1.0相比，T2T-NIP改进了映射特征，如减少了错误定向读对的数量和提高了覆盖均匀性。在基因区域内，读取覆盖率的标准偏差降低了2.0%-4.3%，T2T-NIP作为参考基因组的一大优势是可以更准确地进行基于短reads的定位和变异分析。
研究人员还进行了全基因组关联研究(GWASs)，以评估使用T2T-NIP代替IRGSP-1.0作为参考基因组对遗传分析效率的潜在改进。共鉴定出5个农艺性状的101个相关SNPs；基因编辑实验和表型筛选显示，编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基的基因OsAGPL2发生野生型突变和功能缺失突变的植物单株产量和株高存在显著差异，并鉴定出了OsAGPL2有利单倍型，单株产量显著高于其他单倍型；此外还发现了一些与粒宽相关的T2T-NIP特异性相关SVs。这些结果表明，基于T2T-NIP的群体变异遗传分析和基因挖掘效率更高。
