经典案例 | 砂仁中药材三个变种群体的多组学比较研究
近期，岭南现代农业广东实验室、中山大学药学院和中国医学科学院药用植物开发研究所云南分院联合通讯，在Horticulture Research上发表了成果，报道了阳春砂高质量染色体水平基因组，并在三个砂仁变种群体之间进行了遗传和转录等多组学综合比较分析。
文章题目
Multiomics comparison among populations of three plant sources of Amomi Fructus
第一作者：Xinlian Chen, Shichao Sun
通讯作者：Lixia Zhang, Depo Yang, Li Wang
通讯单位：岭南现代农业广东实验室、中山大学药学院和中国医学科学院药用植物开发研究所云南分院联合通讯
杂志：Horticulture Research
影响因子：8.7/Q1
文章链接：
https://doi.org/10.1093/hr/uhad128
研究背景
砂仁(Sharen, AF)作为一种中药，是姜科豆蔻属多年生草本植物，《中国药典》中对于砂仁的描述包括阳春砂(Wurfbainia villosa var. Villosa，WVV)、绿壳砂(W. villosa var. Xanthioides，WVX)和海南砂(W. longiligularis，WL)三个变种，其挥发性代谢物含量存在较大差异。然而，三个砂仁变种之间遗传分化研究有待明晰。
有研究表明，WvBAT3和WvBAT4可能是BAHD基因家族中两个关键的冰片乙酰转移酶，它们是在WVV种子中合成的。然而，催化冰片合成樟脑的酶尚未在WVV中得到解析。根据冰片和樟脑的化学结构，这一氧化过程可能是由冰片脱氢酶(BDH)催化的，其在WVV中催化冰片合成樟脑的过程机制有待进一步探索。
技术方案
PacBio HiFi和Hi-C测序
系统进化分析
体内实验验证
群体进化研究
研究意义
研究结果对三种砂仁变种的保护、遗传改良和产业化开发，以及利用分子标记鉴定本地适应品种药材和合理临床应用具有重要的指导意义。
▲WVV基因组组装和特征
研究人员通过PacBio HiFi和Hi-C测序对阳春砂(WVV)进行了染色体水平组装，最终获得的基因组大小为2.83 Gb，scaffold N50为112.8 Mb，与已发表的WVV基因组大小(2.80 Gb)基本一致，是姜科其他物种的1.4 ~ 2.9倍。WVV基因组的平均GC含量为40.73%， BUSCO分析显示组装的基因组覆盖率达99.8%。结合从头预测、同源蛋白和转录组学数据，共注释了42,473个编码基因，其中41,506个基因位于24条染色体上。
根据以往的研究，WVV和WVX之间某些次级代谢物含量存在明显差异：WVX中萜烯、α-蒎烯、樟烯和乙酸龙脑酯含量较高；而WVX中芳樟醇、β-月桂烯、龙脑和樟脑含量较高。WVV和WVX的萜类生物合成主要包括三种基因：TPS、BAHD和BDH。
为了研究影响挥发性化合物含量的基因表达模式，研究人员分析了WVV和WVX在不同组织和果实发育阶段参与多种萜烯生物合成的基因的表达，利用WVV基因组中的TPS基因和先前研究中功能验证的TPS基因构建了系统发育树。对WVV的根状茎(Rh)、幼叶(LY)、花(f)、开花后10天果实(P1)、开花后30天果实(P2)、开花后60天果实(P3)、开花后90天果实(P4)和WVX的根状茎(XRh)、幼叶(XLY)、开花后75天果实(XP1)、开花后90天果实(XP2)进行转录组分析，比较两个品种间的表达差异。总的来说，TPS基因在WVV中的表达水平相对高于WVX，并且其高表达并不总是与WVV和WVX的代谢物含量趋势一致。
▲WVV和WVX不同组织和果实发育阶段萜类合成相关基因表达的热图
TPS基因表达水平与其编码酶对应的催化产物含量不一致可能与多种因素有关：
1)WVX缺乏幼果采集，错过了高表达期；
2)不同来源的表达和次生代谢数据；
3)次生代谢物从生物合成组织向其他组织的潜在运输；
4)代谢物含量与其酶表达水平有关，而与其序列同源物的其他拷贝无关；
5)一些TPS基因是多功能的(即能够产生多种次生代谢物)，这使得基因表达水平与其某一产物的相关性不显著。
冰片、乙酸龙脑酯和樟脑是WVV和WVX中最重要的三种化学物质，以冰片为底物，BAHD生成乙酸龙脑酯，BDH生成樟脑。研究人员在基因组中定位了9个BAHD基因，Wv18G0901、Wv13G0223和Wv20G0971在P4期高表达，Wv23G0375在P1期高表达，它们可能是关键的候选基因。
▲不同物种BDH同源蛋白的系统发育树
为了研究BDH基因间的进化关系，研究人员采用极大似然方法构建了系统发育树，发现只有分支I和分支II含有裸子植物BDH，这表明分支III和分支IV可能起源于这两个分支，分支I、II中的BDH蛋白质出现在裸子植物和被子植物分化之前；每个物种BDH分散在不同的分支中，分支I至IV分别包含5、6、5和6个物种，这表明这些物种在获得祖先拷贝后经历了独立进化；分支IV的WVV-BDH基因紧密分布在染色体23和5上，这表明存在一些串联重复事件。
为了进一步缩小候选BDH基因范围，研究人员检测了22个候选基因在不同组织和果实发育阶段的表达水平，发现III支Wv19G0788在P2和P3阶段均高表达，而Wv17G0646在果实各阶段均低表达。然而，Wv19G0788和Wv17G0646在所有组织中的表达水平几乎为零，不可能是候选基因。Wv05G1439、Wv05G1433和Wv05G1432只在WVX果期高表达，而在WVV果期不高表达。两组基因的表达差异可能是导致WVV和WVX樟脑含量差异的根本原因。
▲Wv05G1424和Wv05G1438的体内酶活性测定
当底物为(−)-冰片时，空载体中未检测到任何樟脑，而添加Wv05G1424或Wv05G1438酶的(+)-冰片和异冰片底物的樟脑含量较添加空载体显著提高4-19倍，表明Wv05G1424和Wv05G1438能有效催化(+)-冰片、(−)-冰片和异冰片生成樟脑；进一步研究Wv05G1424和Wv05G1438的表达调控，分别受到17个和112个TFs的调控，包括bHLH、ERF、WRKY、NAC和MYB家族，这些家族在植物生长发育、抗逆性和次生代谢中起着至关重要的作用；此外，Wv05G1424基因受RAV调控，而Wv05G1438基因不受RAV调控；Wv05G1438还受到AP2、bZIP等更独特的TFs(不调节Wv05G1424)的调控。
▲砂仁三个变种的群体遗传分析
重测序的三个砂仁变种来自不同地区，研究者们对组装好的WVV基因组进行定位后确定了24,854,114个SNPs。通过NJ系统发育树和主成分分析表征了WVV-YC、WVV-JH、WVX和WL之间的遗传关系，三个变种分为4个遗传群体，群体进化分析发现广东和云南种植的阳春砂在50年前就发生了遗传分化。为了研究三个变种间的遗传分化，估计了种群分化FST和种内核苷酸多样性，结果表明，由于WVV-YC种群规模较小，人类介导的授粉不能完全补偿近亲繁殖；此外，云南引进的种群在不依赖人工授粉的情况下可能具有较高异交率，从而恢复了遗传多样。
